荷斯坦奶牛瘤胃微生物宏基因组BAC文库的构建与分析

瘤胃微生物生态群落是一个非常复杂的生物网络体系,有着巨大的基因资源以及丰富的生物关系资源。研究表明通过纯培养技术已经分离的种类约有11%,大部分信息仍处于未知状态。采用免培技术研究微生物生态是新型发展的方法,再结合BAC建库技术开展瘤胃微生物宏基因组及功能的研究,在理论与实践都具有重要的意义。 BAC文库构建的核心是获得高纯度的大片段的DNA,而复杂的瘤胃微生物体系中,所含成分非常复杂,掺杂有大量多糖、脂类等抑制分子操作的物质,DNA的提取过程中不可避免地会出现降解。我们已试验了各种方法,通过系统的分类清洗样品,改进包埋和裂解细胞、去除杂质的程序,成功建立了一套能够获得大于2Mb的且纯度较高的瘤胃宏基因组DNA方法,HMW DNA经HindIII不完全酶切电泳回收获得50～100kbDNA片段,将其连接在pCC1BAC载体上,转化E.coli EPI300,得到瘤胃微生物BAC文库,经对文库的鉴定分析,该文库的平均插入片段54.5kb,空载体率小于2%,库容837Mb,共保存15360个克隆。通过连续培养100代的鉴定结果说明该类型BAC克隆的稳定性。 通过直接活性筛选的方法,得到26个具有纤维素酶活性的阳性克隆,16个具有淀粉酶活性的阳性克隆;进一步对这些纤维素酶阳性克隆进行多酶活性的分析,表明每个克隆至少具有2种与纤维素半纤维素降解有关的酶活性,并且酶切指纹图谱呈现不同的类型,间接说明已构建的库内基因的多样性和功能性。 挑取了2个纤维素酶活性较高的BAC克隆进一步构建亚克隆库,得到2个新的纤维素酶基因初步命名为unCMC1和unCMC21,unCMC1完整的阅读框2049bp,编码的蛋白质属于糖苷水解酶家族5,与Butyrivibrio fibrisolvens产生的Endoglucanase的Identities = 408/523 (78%), Positives = 439/523 (83%)。unCMC21的完整的阅读框1013bp,编码的蛋白属于糖苷水解酶家族8,与Yersinia bercovieri产生的Endoglucanase,Identities = 131/308 (42%), Positives = 199/308 (64%),这两个基因序列完全是新的,而且已完成测序部分的unCMC21的上游有2个与纤维素代谢有关的基因,说明了BAC文库在获得新基因及基因簇上具有重要作用。