姜黄素对AGEs诱导软骨细胞TNF-α及MMP-13表达的抑制作用及机制探讨

目的本研究以外源性糖基化终末产物(advanced glycation end products, AGEs)为损伤因子,在体外培养的家兔软骨细胞模型上,观察姜黄素(Curcumin)对AGEs诱导的软骨细胞TNF-α和MMP-13表达的影响,并探讨其相关机制。 方法在原代培养的家兔软骨细胞模型上,(1)观察不同浓度的AGEs对软骨细胞TNF-α和MMP-13 mRNA的表达的影响,并探讨相关机制,实验分为7组：①正常对照组；②(100μg/ml)对照组；③AGEs(1μg/ml)处理组；④AGEs(10μg/ml)处理组；⑤AGEs(25μg/ml)处理组；⑥AGEs(50μg/ml)处理组；⑦AGEs(100μg/ml)处理组。采用RT-PCR方法检测TNF-α和MMP-13mRNA的表达量,试剂盒方法检测CAT、SOD活性及MDA水平。(2)观察不同浓度的Curcumin对AGEs诱导软骨细胞TNF-α和MMP-13 mRNA表达的影响,并探讨相关机制。实验分为7组：①正常对照组；②BSA(100μg/ml)对照组；③AGEs(100μg/ml)处理组；④AGEs(100μg/ml)+curcumin(10μg/ml)处理组；⑤AGEs(100μg/ml)+curcumin (25μg/ml)处理组；⑥AGEs(100μg/ml)+curcumin (50μg/ml)处理组；⑦curcumin(50μg/ml)对照组。采用RT-PCR方法检测TNF-α和MMP-13 mRNA的表达量,荧光探针法检测ROS水平和NF-κB P65的核转位。 结果(1)不同浓度的AGEs (1,10,25,50, 100μg/ml)与软骨细胞共孵育48h后,TNF-α及MMP-13 mRNA的表达较正常对照组明显升高(P<0.05或P<0.01),且均以AGEs浓度为100μg/ml时作用最明显；(2) Anti-RAGE (5μg/ml)与PDTC(0.1mmol/L)能显著抑制由AGEs(100μg/ml)诱导的软骨细胞TNF-a及MMP-13表达增多(P<0.01),而anti-RAGE (5μg/ml)和PDTC(0.1mmol/L)单独处理组与正常对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05)；(3)10,25,50μg/ml的Curcumin与软骨细胞预孵育2h后,可以浓度依赖性的抑制由AGEs诱导的TNF-a及MMP-13mRNA增多(P<0.05或P<0.01),且均以50μg/ml的Curcumin作用最为明显,与AGEs处理组相比,使TNF-a/GAPDH OD比值从1.38±0.04降至0.61±0.02(P<0.01); MMP-13/GAPDH OD比值从0.79±0.04降至0.31±0.02(P<0.01),而50μg/ml Curcumin单独对照组与正常对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)；(4)不同浓度的AGEs (1,10,25,50, 100μg/ml)与软骨细胞共孵育48h后,浓度依赖性地使软骨细胞CAT,SOD活性降低,MDA含量增多,与正常对照组相比差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；10,25,50μg/ml的Curcumin与软骨细胞预孵育2h后,浓度依赖性的拮抗由AGEs所致细胞CAT、SOD活性降低及MDA水平增高(P<0.05或P<0.01),且均以50μg/ml/LCurcumin作用最明显,与AGEs 100μg/ml处理组相比,使CAT活性从2.36±0.31升至11.15±0.52(P<0.01),SOD活性从6.88±0.48升至22.01±0.62(P<0.01),MDA的水平由1.98±0.07降至0.66±0.0(P<0.01)；(5)10,25,50μmol/L的Curcumin能够浓度依赖性地降低软骨细胞中ROS的含量,50μmol/L的Curcumin作用最明显,与AGEs 100μg/ml处理组相比,OD值从0.39±0.009降至0.13±0.005(P<0.01)；且Curcumin能够显著抑制AGEs诱导的软骨细胞NF-κB P65的核转位。 结论1 AGEs能诱导软骨细胞损伤,显著刺激软骨细胞TNF-α和MMP-13表达增多；2 AGEs诱导软骨细胞TNF-α和MMP-13表达增多,其机制与激活RAGE受体,诱导活性氧(ROS)生成增多,激活NF-κB信号通路有关；3 Curcumin可以显著抑制由AGEs诱导软骨细胞TNF-α和MMP-13表达增多；4 Curcumin可能通过抑制RAGE/ROS/NF-κB信号通路,抵抗AGEs所致软骨细胞损伤,从而起到防治骨关节炎病变的作用。