SIPA1通过下调Rap1-ERK通路抑制HCC的复发转移

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是当前严重威胁我国人民生命健康的最主要恶性肿瘤之一。随着肝脏外科技术以及麻醉与围手术期处理水平的进步,肝癌的手术切除率显著提高,在一些大的肝脏外科中心肝癌手术死亡率已接近为零。尽管如此,以5年生存率为标志的肝癌整体治疗水平仍无显著改善,究其原因在于肝癌术后的复发转移率居高不下。据统计,肝癌切除术后5年的复发率高于60%,小肝癌也在40%以上。显然,肝癌的复发、转移已成为严重制约肝癌患者长期存活的关键因素。因此,深入研究肝癌复发转移机制,积极探索有效的抗复发治疗措施是当前肝癌诊治中的重点和难点,对于进一步改善肝癌患者长期存活率具有重要意义。 已有的研究证实,SIPA1 (Signal-induced Proliferation-associated Gene 1,信号诱导的增殖相关基因1)在血液系统肿瘤的发生发展过程中发挥了非常重要的作用。新近的研究表明小鼠sipa1是决定小鼠乳腺癌转移倾向的重要基因。众所周知,肝脏是胚胎时期的重要造血器官,血细胞(如血小板)与肿瘤的转移密切相关。根据以上的研究结果我们推测SIPA1基因很可能在HCC复发转移中发挥重要作用。因此,本课题在研究SIPA1在临床肝癌病例及肝癌细胞系中表达情况的基础上,进一步通过质粒构建转染技术上调SIPA1的表达,并综合利用一系列体外、体内方法研究SIPA1调控HCC侵袭转移的分子机制。我们获得了如下研究结果： 1.我们首先采用RT-PCR和Western blot等方法检测了SIPA1 mRNA和蛋白在30例新鲜HCC组织及相应邻近非癌肝组织(ANLT)中的表达水平,结果发现与ANLT比较,SIPA1 mRNA和蛋白水平在癌组织中表达均显著下调(P<0.05),且肝癌组织中SIPA1 mRNA和蛋白表达水平呈明显正相关(r=0.757,P<0.001)。进一步采用实时定量PCR检测显示ANLT中SIPA1 mRNA表达量为癌组织的4.17倍。进而,我们采用免疫组化技术检测了130例HCC组织中SIPA1的表达,结果显示SIPA1主要分布于细胞浆内,其在癌组织的阳性表达率为62.3%(81／130)。肝癌组织中SIPA1低表达与肿瘤多结节,分化差及静脉侵袭密切相关(P<0.05)。SIPA1阴性表达组HCC患者的总体生存时间显著短于SIPA1阳性表达组的患者(41.0±6.6个月vs.66.0±5.2个月,P=0.003),SIPA1阴性表达组的无瘤生存时间亦显著短于SIPA1阳性表达组(35.0±6.1个月vs.61.1±5.4个月,P=0.002)。多元Cox回归模型显示SIPA1阴性表达是HCC预后的独立危险因素。 2. RT-PCR及Western blot方法检测SIPA1 mRNA和蛋白在HepG2、MHCC97-L和HCCLM3这3种侵袭转移潜能依次升高的肝癌细胞系中的表达水平,并以正常肝细胞系L02、常氏肝细胞系CCL13作为对照。结果显示SIPA1 mRNA和蛋白在HepG2、HCCLM3和MHCC97-L肝癌细胞系中的表达水平显著低于CCL13和L02正常肝细胞系(P<0.05),且其表达水平在HepG2. MHCC97-L、HCCLM3细胞中依次降低(P<0.05),提示SIPA1表达水平与肝癌细胞的侵袭转移潜能呈负相关。同时确定以SIPA1表达水平最低的HCCLM3为过表达质粒的靶细胞。 3.我们构建了重组质粒pcDNA3.1-SIPA1,使用Lipofectamine 2000转染并行G418筛选,经RT-PCR和Western blot等方法验证SIPA1的表达,最终获得了稳定转染细胞系HCCLM3SIPA1+和空质粒对照组HCCLM3vector细胞。采用MTT法、粘附实验、划痕愈合实验和Transwell等实验方法分别检测两组细胞在细胞增殖与粘附能力、迁移运动能力和侵袭能力上的差别。MTT研究结果显示,HCCLM3SIPA1+的细胞增殖能力较HCCLM3vector显著下降(P<0.05)；粘附实验结果显示与HCCLM3vector细胞相比,HCCLM3SIPA1+细胞与FN的粘附能力明显减弱(P<0.05)；划痕愈合实验和Transwell侵袭实验显示HCCLM3SIPA1+与HCCLM3vector相比,细胞的迁移运动能力和侵袭能力均显著下降(P<0.05)。以上体外实验研究结果证实上调SIPA1的表达可显著抑制HCC细胞的增殖、粘附、迁移和侵袭能力。进一步采用免疫荧光技术检测HCCLM3SIPA1+细胞和HCCLM3vector细胞的骨架蛋白F-actin的形成情况,发现SIPA1能明显减少F-actin的形成。 4.为进一步体内观察上调SIPA1对肝癌侵袭转移的影响,我们建立了裸鼠原位肝癌肺转移模型。结果显示,HCCLM3SIPA1+细胞在肝脏中成瘤体积明显较HCCLM3vector细胞小,分别为1.57±0.08cm3和6.28±0.13cm3,(P<0.05)。通过裸鼠肺组织连续切片观察肺转移灶的发生率,发现与HCCLM3vector组相比,HCCLM3SIPA1+组的肺转移率显著下降(16.7%vs.83.3%,P=0.021)。由此证明,上调SIPA1可显著抑制肝癌细胞的体内成瘤能力和侵袭转移能力。 5.综合已有的研究,我们推测SIPA1可能通过Rapl-ERK信号传导通路调控肝癌细胞的侵袭转移。为证实上述假说,我们首先检测了HCCLM3SIPA1+细胞和HCCLM3Vector细胞中Rap1的活性,研究发现与后者相比,过表达SIPA1的HCCLM3SIPA1+细胞中,Rap1的活性显著降低(P<0.05)；免疫共沉淀技术亦证实HCCLM3SIPA1+细胞中SIPA1与Rap1存在直接的相互作用。进而,我们采用Rap1激活因子8CPT-2Me-cAMP(终浓度100μM),恢复HCCLM3SIPA1+细胞中Rap1的活性,反向验证Rap1在SIPA1调控肝癌侵袭转移中的作用。结果发现,恢复Rap1的活性后,细胞的迁移运动能力和和侵袭能力得到显著恢复(P<0.05)且细胞骨架蛋白F-actin表达亦得到明显恢复。Western blot证实HCCLM3SIPA1+细胞中Rap1下游基因ERK的磷酸化水平显著下降(P<0.05),恢复Rap1活性后p-ERK的表达得到恢复。上述研究结果证实,SIPA1可通过下调Rap1-ERK信号传导通路抑制肝癌细胞的侵袭转移。 综上所述,我们首次发现SIPA1在肝细胞癌组织中的表达显著下调,其表达水平与肝癌分化差、多结节、静脉侵犯等临床病理特征密切相关,同时与肝细胞癌预后差和术后早期发生复发转移等密切相关。SIPA1是肝细胞癌预后的独立危险因素,可作为预测肝细胞癌术后生存和复发转移的分子标志物。体内、体外研究证明,SIPA1通过下调Rap1-ERK信号通路抑制肝细胞癌的增殖和侵袭转移能力。