DNA条形码与SRAP标记在软枣猕猴桃种质资源鉴别中的应用

软枣猕猴桃[Actinidia arguta(Sieb.et Zucc.)Planch.exMiq.],又名软枣子、藤梨、藤瓜,是猕猴桃科猕猴桃属多年生落叶藤本植物,雌雄异株。其果实光滑无毛可直接食用,营养丰富,味道独特,富含维生素C,是优质的新兴水果。DNA条形码(DNA barcoding)技术是一种以分子进化为基本原理,利用一段短的、标准的DNA片段对物种进行准确、快速鉴别的分子生物学技术。相关序列扩增多态性标记(SRAP,sequence related amplified polymorphism)是2001年开始应用的随机引物标记,具有操作简单、重复性高、成本较低的优点,目前SRAP标记已被应用于遗传多样性分析、遗传图谱构建等领域。由房经贵等开发的人工绘制品种鉴别示意图法(MCID,manual cultivar identification diagram)结合分子标记能够快速鉴别植物品种,具有直观清晰、实用性强的优点。本研究利用DNA条形码和SRAP标记的方法对44份软枣猕猴桃种质资源进行了分子水平的鉴别研究,试验主要结果如下:1.条形码序列分析:选用5个候选的条形码片段(ITS、ITS2、matK、rbcL、trnH-psbA),其中候选条形码片段ITS测序结果出现双峰,测序成功率低(27.78%),予以淘汰。其余四个候选条形码片段序列获得率较高,可以进行鉴别试验。2.DNA条形码鉴别软枣猕猴桃种质的评价:不同种质之间遗传距离较小,barcoding gap分析表明种质间与种质内没有明显的‘gap’区;NJ系统进化树分析显示多数种质聚类至同一分支中,仅有小部分资源能够区分。总体评价认为该方法对参试软枣猕猴桃种质鉴别效率较低。3.DNA条形码结合SNP位点的资源鉴别分析:发现44份种质资源在ITS2序列上存在4个稳定的变异位点,matK序列具有1个稳定变异位点。DNA条形码结合SNP分析构建MCID鉴别图谱,实现部分资源鉴别,但总体鉴别效率偏低。4.条形码在猕猴桃属物种水平上的鉴别评价:Barcoding gap分析显示种内和种间遗传距离分布存在明显的‘gap’区域,系统发育树分析显示各参试猕猴桃种能够得到单独的分支,表明DNA条形码可在物种水平区分猕猴桃属植物并鉴定软枣猕猴桃。5.SRAP标记引物筛选:以软枣猕猴桃品种‘丰绿’和‘魁绿’基因组DNA为PCR模板筛选SRAP引物组合,最终从208对引物组合中筛选出5对多态性好、条带清晰的引物组合。6.利用SRAP标记构建44份种质的MCID鉴别图谱:以筛选出的5对引物组合对44份种质资源进行PCR扩增,根据电泳条带结果构建了44份软枣猕猴桃种质的MCID图谱。7.两种分子标记方法的比较与应用:DNA条形码可在种水平上区分鉴别不同物种,种内水平鉴别效果较差;SRAP标记则可在品种水平上鉴别不同种质资源。在实际鉴别工作当中可根据实际需要选择合适的鉴别方法。