基于5-HT信号系统探讨电针治疗便秘型肠易激综合征的机制

背景:肠易激综合征是临床最常见的功能性胃肠病。IBS病因及发病机制复杂,目前认为脑肠互动异常引起的内脏敏感性增加和肠动力异常构成了 IBS的病理生理基础。IBS临床较难治愈,消耗大量社会医疗资源。患者及家庭承受病痛、心理和经济三重压力。针灸能显著缓解IBS患者腹痛、排便功能紊乱等症状,提高患者生存质量。但迄今为止针灸治疗IBS的机制尚未完全阐明。目的:5-HT是参与肠道动力、感觉调节的重要化学信号和神经递质。5-HT3型和5-HT4型受体及5-HT转运体是其肠道代谢途径的主要受体,也是目前研究的热点。鉴于5-HT信号系统对肠功能的重要调节作用及与IBS病机的密切相关性,本文立足于验证"针灸通过调节5-HT信号系统治疗IBS-C"这一科学假设,旨在阐述电针治疗IBS-C的重要作用机制。方法:本研究以野生型（Wildtype,WT）C57BL6小鼠和Htr4基因敲除小鼠（Htr4+/-）为研究对象。C57BL6小鼠分为WT空白组、WT模型组和WT模型电针组,采用冰水灌胃法构建IBS-C模型并评价;采用Crispr/Cas9法构建Htr4+/-小鼠模型并评价,构建成功后分为Htr4+/-模型组和Htr4+/-模型电针组。通过检测首粒黑便排出时间、粪便颗粒数和含水量、结肠肌电评价电针对IBS-C模型小鼠胃传输功能的影响;通过糖水消耗试验评价IBSC-模型小鼠心理行为学改变;通过酶联免疫吸附法、免疫组织化学法、免疫印迹法、RT-PCR等分子生物学技术观察各组小鼠血清及结肠组织5-HT含量,结肠5-HT3受体、5-HT4受体及SERT蛋白含量及mRNA表达,以阐明电针对IBS-C模型小鼠5-HT信号系统的调控作用。结果:（1）模型评价:与WT空白组相比,WT模型组小鼠首粒黑便排出时间延长,粪便颗粒数减少、含水量下降,糖水偏好度下降,结肠肌电频率增加,幅值增大,变异系数升高,差异均有统计学意义（P<0.05）;Htr4+/-模型组首粒黑便排出时间显著延长,粪便颗粒数减少,含水量显著较正常值下降,糖水偏好度,结肠肌电频率增加,幅值增大,变异系数升高,差异有统计学意义（P<0.05）。（2）电针对胃肠道传输功能的影响:与WT模型组相比,WT模型电针组小鼠首粒黑便排出时间缩短、粪便颗粒数增加,含水量升高。结肠肌电慢波频率降低,幅值减少,变异系数降低,差异有统计学意义（P<0.05）;与Htr4+/-模型组相比,Htr4+/-模型电针组小鼠首粒黑便排出时间缩短（P<0.05）、粪便颗粒数增加（P>0.05）,含水量升高（P>0.05）。结肠肌电慢波放电频率降低,放电频率变异系数降低,差异有统计学意义（P<0.05）。幅值、幅值变异系数有下降趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）。（3）电针对5-HT的影响:与WT空白组比,WT模型组、Htr4+/-模型组血清5-HT含量及结肠组织5-HT表达均显著增加（P<0.05）;与WT模型组相比,WT模型电针组小鼠血清和结肠5-HT水平下调,差异有统计学意义（P<0.05）;与Htr4+/-模型组相比,Htr4+/-模型电针组小鼠血清和结肠5-HT水平下调,差异无统计学意义（P>0.05）。（4）电针对结肠5-HT4R、5-HT3R的影响:与WT空白组比,WT模型组、Htr4+/-模型组结肠5-HT4R蛋白含量及mRNA表达均明显下降,差异有统计学意义（P<0.05）。与WT模型组相比,电针干预后,WT模型电针组结肠5-HT4R蛋白含量及mRNA表达均上调（P<0.05）,差异有统计学意义。与Htr4+/-模型组比,Htr4+/-模型电针组结肠5-HT4R蛋白含量上调,但差异无统计学意义（P>0.05）。5-HT4RmRNA表达上调,差异有统计学意义（P<0.05）与WT空白组比,WT模型组结肠5-HT3R蛋白含量及mRNA表达均明显下降,差异有统计学意义（P<0.05）;Htr4+/-模型组5-HT3R蛋白含量及mRNA表达均显著上升（P<0.05）。电针干预后,WT模型电针组结肠5-HT3R蛋白含量及mRNA表达较WT模型组均上调（P<0.05）;Htr4+/-模型电针组结肠5-HT3R蛋白含量及5-HT4RmRNA较Htr4+/-模型组明显下调,差异有统计学意义（P<0.05）(5)电针对结肠SERT的影响:WT空白、WT模型组、WT模型电针组、Htr4+/-模型组、Htr4+/-模型电针组结肠SERT蛋白含量及mRNA表达比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论:（1）冰水灌胃法可以复制便秘型肠易激综合征动物模型,模型小鼠首粒黑便时间延长、粪便颗粒数减少、含水量降低、糖水偏好度下降,慢性冰水刺激可以促进EC过度释放5-HT,诱导5-HT信号系统紊乱,继而导致肠道动力、感觉异常;Htr4+/-模型组表现为先天5-HT4R受体表达下调,5-HT信号系统紊乱,出现粪便颗粒数减少、含水量降低、糖水偏好度下降等类IBS-C症状,证实了 5-HT4受体是胃肠道5-HT信号系统的关键受体。两种IBS-C模型的成功建立,一方面证实5-HT信号系统异常是IBS-C的重要发病机制,另一方面提示在5-HT信号系统中,任何平衡被打破,都会继发整个代谢过程功能紊乱,导致疾病的发生。（2）电针可以良性下调冰水灌胃IBS-C模型及Htr4+/-模型小鼠异常升高的血清5-HT含量及结肠组织5-HT表达;上调冰水灌胃IBS-C模型及Htr4+/-模型小鼠结肠5-HT4R蛋白及mRNA含量;上调冰水灌胃IBS-C模型小鼠结肠组织中表达减少的5-HT3R,而下调Htr4+/-模型电针组表达异常增高的5-HT3R。促使5-HT、5-HT4R、5-HT3R恢复正常水平。提示了电针可以通过调节5-HT释放、激活各个环节达到调控5-HT信号系统的作用。体现了针灸双向、良性调节的优势。（3）电针可以通过良性调控5-HT信号系统,改善肠道动力和肠道分泌,达到治疗IBS-C的效果,从而改善冰水灌胃和Htr4+/-基因敲除所致的胃肠动力紊乱,增强胃肠动力、增加粪便颗粒数、含水量、促使结肠肌电恢复正常节律,缓解IBS-C模型小鼠排便困难的症状。