铂类抗肿瘤药体外肾毒性的比较研究

利用永生化传代细胞模型在药物开发早期优化筛选先导化合物，并比较结构相似化合物的相对毒性，是近年来药物发现毒理学研究的热点。肾脏是药物毒副作用的主要靶器官之一，而肾近端小管拥有庞大的转运系统和丰富的生物转化酶，对外源性毒物的损害特别敏感，是研究药物肾毒性可靠的细胞模型。目前国内外常用的研究模型是OK和LLC-PK1细胞，然而OK细胞不表达肾近端小管细胞标志酶——碱性磷酸酶和γ-谷氨酰转肽酶，而LLC-PK1细胞因缺乏葡萄糖-6-磷酸酶和己糖激酶，无法进行糖原异生。人肾小管上皮细胞系(HK-2细胞)不仅排除了从实验动物外推到人的种属差异，而且能够表达肾小管大部分标志酶，功能更加接近原代培养的肾小管上皮细胞，目前尚未见到利用该细胞系进行药物体外肾毒性优化筛选的报道。铂类配合物的研发是当前抗肿瘤药研发活跃的领域之一，顺铂(cisplatin，CDDP)是临床常用的广谱抗肿瘤药，但严重的肾毒性限制了其在临床上的应用，卡铂(carboplatin，CBDCA)是在顺铂结构基础上开发的第二代铂类抗肿瘤药，其抗瘤谱与顺铂相近，肾毒副作用低于顺铂，但只能静脉注射，目前临床上一般只在治疗晚期或难治的恶性肿瘤、需要高剂量方案时才用卡铂取代顺铂。双环铂(dicycloplatin，DCP)是在卡铂结构基础上我国自行合成的第一个铂类抗肿瘤药，其抗瘤谱广、抗瘤活性强、水溶液稳定，可以口服给药，目前正处于临床试验阶段，具有良好的开发前景，对于其毒性作用靶器官和毒副作用机制等尚无公开报道。本研究利用人肾小管上皮HK-2细胞对三代铂类抗肿瘤药的肾毒性进行比较，结合体内实验来验证该细胞的特异性和敏感性，并利用该细胞从凋亡角度对铂类抗肿瘤药的肾毒性机制进行了初步探讨。这不仅为药物体外肾毒性筛选模型的建立奠定了良好的基础，而且为双环铂临床应用以及毒副作用监测提供参考，并为铂类配合物的合成提供了有益的毒理学资料。 本研究首先对永生化的人肾小管上皮细胞(HK-2)用于体外药物肾毒性研究的 铂类抗肿瘤药体外肾毒性的比较研究 摘要 可能性进行了评价，选择临床上常用的具有明显肾毒性的药物(顺铂、环抱素A和 两性霉素B)以及临床已经证实没有肾毒性的药物(阿司匹林、阿莫西林和环磷酞 胺)，检测上述药物对HK一2细胞的毒作用与临床是否一致。结果发现临床上肾毒性 比较明显的药物，在10～50娜。比剂量就能够对HK一2细胞产生明显的细胞毒性作 用，临床上没有肾毒性的药物在高出约100倍的剂量下才可能产生相同效应，例如 顺铂引起HK一2细胞周期明显改变以及LDH漏出增加的剂量是5林mol几，环抱素A 和两性霉素B发生相同效应是25～50脚。比，而阿司匹林、阿莫西林和环磷酞胺 即使在1000林mol几也未引起HK一2细胞上述指标的显著性改变。因此，利用HK一2 细胞作为模型对铂类抗肿瘤药进行体外肾毒性的比较研究是可行的。其次我们以 M竹和LDH漏出检测三代铂类抗肿瘤药物的细胞毒性，流式细胞仪PI染色检测细 胞周期以及Annexin一V用I双染色检测细胞凋亡，叭触stem蛋白印迹检测热休克蛋白 (HSP70)和免疫荧光法检测金属硫蛋白(MT)的表达，从细胞和分子水平对三代 铂类抗肿瘤药的肾毒性进行比较研究;同时也对三代铂类抗肿瘤药的体内肾毒性进 行了比较，观察SD大鼠重复静脉注射三代铂类抗肿瘤药后肾毒性相关的血液学、 血液和尿液生化指标及组织病理学的改变，验证体外肾毒性与体内实验是否一致。 结果发现顺铂对HK一2细胞的毒性将近卡铂或双环铂的100倍(ICS。分别为13.6士 1.53阿01/L，1149.9士30.3脚01几和1180.6士31.1脚。比)，Jl项铂在5林mol/L就能够 诱导HK一2细胞凋亡早期细胞由对照2.巧%上升到11.36%，凋亡晚期和死亡细胞由 对照3.62%升高到10.42%。而卡铂是在1000阿。讥时引起凋亡晚期和死亡细胞出 现有统计学意义的增加，双环铂是在500脚。比引起同样变化。体内实验表明，给 药结束时顺铂高剂量组(0 .gmg/Kg)血尿素氮(BIJN)和肌昔(Crea)与空白对照 组相比均显著升高，至恢复期上述改变仍存在。卡铂、双环铂上述指标在给药结束 时和恢复期与相应空白对照组相比均无显著差异，可见双环铂对SD大鼠的肾毒性 明显低于顺铂，而与卡铂相近，这与体外实验结果是吻合的。此外在比较了三代铂 类抗肿瘤药肾毒性大小的基础上，我们从细胞凋亡角度对铂类抗肿瘤药肾毒性的机 制进行了初步探讨。结果发现三代铂类抗肿瘤药均能诱导HK一2细胞casapase一9和 eas叩ase一s表达升高，将easpaseg抑制剂z一LEHD一FMK和easpases抑制剂 z一佗TD一FMK预先处理HK一2细胞，然后以顺铂诱导细胞凋亡，发现与单纯药物组 军事医学科学院毒物药物研究所 第2页共64页 铂类抗肿瘤药体外肾毒性的比较研究摘要 相比，无论是凋亡早期或是凋亡晚期细胞都出现不同程度的减少。Z一LEHD一FMK、 Z一IETD一FMK也能够减少卡铂和双环铂对HK一2细胞的凋亡诱导效应，但此时的变 化与相应的药物组相比没有显著性差异。 本研究利用HK-2细胞对顺铂、卡铂和双环铂三代铂类抗肿瘤药的体外肾毒性 进行了比较研究，并初步探讨了铂类抗肿瘤药对HK一2细胞肾毒性可能的机理。得 出以下主要结论:1.HK一2细胞