地榆活性成分抑制肿瘤血管生成作用及机理研究

目的：筛选地榆抗肿瘤血管生成活性成分,研究地榆活性成分抗肿瘤血管生成作用,并探讨其作用机制。方法：①地榆抗肿瘤血管生成活性部位筛选：采用系统溶剂提取法制备地榆石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水共5个不同极性部位；以HUVEC、MCF-7、 Bel-7402三种细胞增殖模型,采用SRB染色法筛选地榆抗肿瘤血管生成的活性部位：②活性部位馏分分离、活性馏分筛选与鉴定：采用制备型HPLC从地榆正丁醇活性部位中分离不同馏分；以HUVEC、MCF-7、Bel-7402三种细胞增殖模型,采用SRB染色法筛选地榆抗肿瘤血管生成活性馏分；面积归一化法计算样品的纯度,MS和H-NMR对活性成分进行结构鉴定。③活性成分(鞣花酸)抗肿瘤血管作用研究：以HUVEC细胞模型,采用SRB法、划痕法及Matrigel体外成管实验分别考察鞣花酸对HUVEC增殖、迁移及小管形成的影响；体内建立S180、H22皮下荷瘤小鼠模型,随机分为模型组(0.5%CMC溶液)、环磷酰胺组(阳性对照,20 mg/kg)、鞣花酸高、中、低(200、100、50 mg/kg)剂量组,连续给药10 d,观察鞣花酸对荷瘤小鼠肿瘤生长、体重、胸腺指数及脾脏指数的影响,免疫组化法检测肿瘤微血管密度。④鞣花酸抗肿瘤血管作用机理研究：采用RT-PCR法、ELISA法、Western blotting法分别观察鞣花酸对HUVEC细胞PDGFB mRNA表达、对细胞上清中PDGFB分泌及对细胞中PDGFB、 STAT3、p-STAT3蛋白表达水平的影响；免疫组化法测定S180、H22荷瘤小鼠肿瘤组织中PDGFB、p-STAT3及STAT3的表达情况。结果：①地榆正丁醇提取部位显著抑制HUVEC、MCF-7、Bel-7402三种细胞增殖(P<0.01或P<0.05)。②从正丁醇部位中共获得22种馏分(1-22#)；5#馏分(20μg/mL)对HUVEC、MCF-7、Bel-7402三种细胞增殖均有显著抑制作用(P<0.01或P<0.05)；MS、H-NMR结果显示,5#馏分为鞣花酸。③鞣花酸(20、10、5μg/mL)显著抑制HUVEC增殖、迁移和小管形成(P<0.01或P<0.05),其增殖抑制作用呈时间和浓度依赖性,其迁移和小管形成抑制作用呈剂量依赖性。④鞣花酸(200,100,50 mg/kg)显著抑制S180、H22小鼠肿瘤生长,对小鼠体重无影响。鞣花酸高剂量组对S 180、H22小鼠脾脏指数较模型组显著上升(P<0.05)。鞣花酸高、中剂量组能显著降低S180、H22小鼠肿瘤微血管密度(P<0.05)。⑤鞣花酸(20、10、5μg/mL)能显著降低HUVEC细胞中PDGFB基因和蛋白表达水平(P<0.01或P<0.05),降低STAT3蛋白的磷酸化水平(P<0.01或P<0.05),而对STAT3蛋白表达总量无变化。与模型组比较,鞣花酸给药组在S180、H22两种瘤体中PDGFB.p-STAT3和STAT3的表达明显降低。结论：地榆活性成分鞣花酸具有良好的抗肿瘤及抗肿瘤血管生成作用,其机制可能与下调PDGFB表达并抑制下游STAT3的蛋白表达及磷酸化有关。