扶正祛毒方及其单体成分贝母素经干预乳腺癌干细胞所诱导上皮—间质转化防治乳腺癌转移的机制研究

立题依据：肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSCs)自我更新、分化增殖、抗凋亡、极强的成瘤能力以及促上皮-间质转化(EMT)是促进肿瘤生长、转移的重要原因。其中EMT能够显著增强肿瘤细胞侵袭性及迁移能力,研究认为CSCs较一般肿瘤细胞具有更高水平的EMT,因此可能是乳腺癌干细胞促肿瘤转移的主要途径。乳腺癌微环境中转化生长因子-β(TGF-β)被认为是EMT过程的主要诱导因子之一,启动Smad通路,可能是介导EMT的关键途径之一。本研究基于中医药扶正祛毒法,拟通过“扶正祛毒方”(RHDT)及其单体成分贝母素甲、乙,对由4T1细胞所培养、分离及纯化的乳腺癌干细胞的干预作用进行研究,深入探讨RHDT及贝母素对乳腺癌干细胞上皮-间质转化的调控作用,立足于中医药对肿瘤干细胞微环境的干预角度以防治乳腺癌的侵袭、转移,为今后进一步研究肿瘤干细胞生物学行为、对恶性肿瘤转移的影响及其分子机制提供新的科学依据。 研究方法：基于4T1炎性乳腺癌细胞系培养、分离和纯化乳腺癌干细胞(BCSCs),并进行干细胞表型及功能评价,比较BCSCs与4T1细胞EMT相关蛋白水平及其微环境中促肿瘤转移相关因子(VEGF, TGF-β, MMP-9, TF)水平,以及中药复方扶正祛毒方及其单体成分贝母素的干预调控作用,观察TGF-β诱导4T1细胞侵袭、迁移水平,对照观察BCSCs组与4T1组细胞TGF-β/Smad2/3/4信号通路的激活状况,及EMT相关关键表型蛋白的表达水平,包括上皮表型E-cad蛋白,和间质表型N-cad、VIM、FN及MMP-9蛋白的检测,拟从调控肿瘤干细胞微环境的角度,揭示扶正祛毒方及其单体成分贝母素防治乳腺癌转移的科学内涵。 研究结果： (1)4T1细胞于SFM中无血清培养5-7天可见小部分细胞形成干细胞微球(TumorSpheres)并进一步增殖自我更新,传代三次以上TumorSpheres获得相对纯化。对4T1细胞及TumorSpheres进行CD24-/lowCD44+表型评价,4T1组CD24-/lowCD44+表面标记检测结果为(0.11+0.05)%,而TumorSpheres为(82.56+4.13)%(P<0.01)。3天、5天、7天时TumorSpheres生长增殖率分别为51.42%、100%及146%；TumorSpheres CD24-/low CD44+/Ki-67+细胞增殖能力9day>6day>3day,(p<0.05);通过血清诱导可迅速分化并增殖;TumorSpheres凋亡水平显著低于一般4T1细胞,p<0.01。初步证明TumorSpheres与BCSCs特征相符。 (2)液相质谱检测联用对RHDT中贝母素甲及贝母素乙单体含量检测结果显示,不同方法制备两份RHDT样本分别含贝母素甲8.42ug/ml、16.61ug/ml,贝母素乙6.26ug/ml、12.42ug/ml。 (3)观察RHDT.贝母素甲、贝母素乙及顺铂对4T1细胞与BCSCs的抑制率,结果显示RHDT、贝母素甲、贝母素乙及顺铂均对4T1细胞及BCSCs有明显抑制作用,抑制率大小依赖于时间及浓度,BCSCs各药物干预组细胞IC50高于4T1各药物干预组,但无统计学意义。贝母素甲、贝母素乙、RHDT及顺铂对BCSCs与4T1细胞均具有显著促凋亡作用(p<0.01),说明BCSCs具有更高水平抗凋亡能力。 (4)EMT相关检测(WB,RT-PCR)示：EMT关键上皮表型标记物E-cadherin蛋白表达水平,4T1组>BCSCs组(p<0.05)；重要间质表型标记物N-cadherin,VIM,FN蛋白表达水平BCSCs组>4T1组(p<0.05)。表明BCSCs较4T1细胞更易于发生EMT。 (5) RHDT.贝母素甲、贝母素乙对BCSCs EMT干预作用结果显示,BCSCS组内E-cad蛋白：4T1阴性对照组>DDP组>BCSCs阴性对照组>RHDT组>贝母素甲组>贝母素乙组,贝母素乙组E-cad mRNA水平明显下降,p<0.05。主要间质表型标记物VIM结果显示,贝母素甲组、贝母素乙组、RHDT组及DDP组VIM mRNA表达水平均显著下降,p<0.01, BCSCs阴性对照组>贝母素甲组>DDP组>4T1阴性对照组>RHDT组>贝母素乙组。BCSCS组内间质表型FN结果示,RHDT组>贝母素甲组>BCSCs阴性对照组>贝母素乙组>DDP组>4T1阴性对照组,贝母素乙组显著下降,p<0.01。 (6) Transwell侵袭实验结果显示,4T1细胞组与经TGF-β刺激的4T1细胞组二者侵袭过膜细胞数具有明显差异,即TGF-β/4Tl组>4T1组(p<0.01)；而迁移实验结果示,TGF-β/4T1组>4T1组(p<0.01),即当TGF-β因子对4T1细胞刺激24h后,4T1细胞侵袭性与迁移性显著增加。表明TGF-β可能是诱导EMT发生的关键启动因子。 (7)关于EMT机制,4T1细胞与BCSCs两组TGF-β自分泌水平比较结果显示,BCSCs组>4T1组(p<0.01)；贝母素乙组可显著抑制TGF-p mRNA表达水平p<0.01; RHDT、贝母素甲及贝母素乙均可降低Smad通路Smad2/3磷酸化水平,抑制Smad4表达；同时贝母素乙、RHDT对下游Twistl mRNA表达水平亦具有显著抑制作用p<0.01。表明RHDT、贝母素甲及贝母素乙对BCSCs EMT的调控作用可能通过下调TGF-β/Smad实现的。 (8) RHDT、贝母素甲及贝母素乙对BCSCs及4T1细胞微环境中促肿瘤转移相关细胞因子的干预作用结果显示,VEGF4T1组贝母素甲组、RHDT组及DDP组经药物干预后VEGF蛋白含量水平均显著下降,p<0.05；TGF-p BCSCS组及4T1组：阴性对照组>贝母素甲组>贝母素乙组>RHDT组>DDP组(p<0.01)；贝母素乙对BCSCs及4T1细胞MMP-9具有明显抑制作用p<0.05。 结论： ①通过表型及基本功能检测可以认为4T1乳腺癌细胞系能够培养、分离乳腺癌干细胞(BCSCs), BCSCs高表达CD24-/low CD44+表型,并具有自我更新、分化增殖、抗凋亡能力； ②扶正祛毒方(RHDT)、贝母素甲及贝母素乙对4T1细胞及BCSCs具有明显抑制作用,经液质联合检测认为贝母素甲及贝母素乙是RHDT有效成分之一； ③RHDT、贝母素甲及贝母素乙可显著诱导4T1细胞及BCSCs凋亡,且BCSCs相较一般4T1细胞具有更强的抗凋亡作用； ④乳腺癌干细胞较一般4T1乳腺癌细胞更易发生上皮-间质转化； ⑤RHDT及贝母素乙能够明显抑制BCSCs上皮-间质转化关键蛋白表达,对EMT发挥调控作用； ⑥通过挖掘BCSCs易发生上皮-间质转化的分子机制,发现TGF-p可显著诱导4T1细胞发生侵袭及迁移,是BCSCs发生上皮-间质转化的主要诱导因素之一；RHDT.贝母素甲及贝母素乙,尤其是贝母素乙,对EMT的调控作用可能通过下调TGF-β/Smad通路以降低间质表型标记蛋白水平、提高上皮表型标记蛋白来实现。 ⑦RHDT、贝母素甲及贝母素乙,尤其是贝母素乙,可改善微环境中促肿瘤转移因子的表达水平,如VEGF、MMP-9、TF、TGF-β。