子宫内膜异位症(endometriosis,EMT)简称内异症,近年来越来越引起妇产科临床的关注,多见于育龄期妇女,被定义为具有生长功能的子宫内膜组织(腺体和间质)出现在宫腔被粘膜覆盖以外部位时引起的病症。其所引起的痛经、慢性盆腔疼痛、不孕等严重影响广大妇女的身心健康甚至威胁到家庭和谐,且其发病率越来越高,目前,EMT约占育龄妇女的10%-15%,占痛经妇女的40%-60%,不孕患者30%-40%合并EMT,而在EMT患者中,不孕症的发病率约40%-60%。EMT虽为良性疾病,却具有和肿瘤相似的浸润、侵袭特征,被称为“良性癌”。异位内膜除了可侵犯盆腔脏器和腹膜(以侵犯卵巢和宫骶韧带最常见),还可侵犯子宫、子宫直肠陷凹、腹膜脏层、阴道直肠膈等部位,全身任何部位均可能发病。近年来,国内外学者均对EMT进行了大量的基础与临床研究,但至今尚未搞清其明确病因及发病机制,治疗效果也十分有限。EMT的治疗方法较多,其中以药物(内分泌)治疗、手术治疗和综合治疗为主,但只有切除子宫和双附件的根治性手术治疗效果较为确切,其余治疗方法均有很高的复发率。而切除子宫和双附件无疑剥夺了广大育龄期病患的生育权,且使她们彻底丧失内分泌功能,这些都是不容忽视的问题。目前尚未发现一种治疗方法能够既有较好的治疗效果,又无严重副作用,针对EMT的大多数药物均会导致体重增加、肝功能损伤以及绝经期综合征等副作用,长时间连续使用会引起严重的身心损害。因此,寻找更有效的EMT治疗方法成为国内外学者共同关注的问题。环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)是一种限速酶,可以催化磷脂花生四烯酸合成前列腺素类物质,其催化产生的前列腺素是一类重要的炎症因子,具有抑制细胞凋亡、抑制免疫监视等多种活性,参与炎症和肿瘤过程,并且可以通过多重途径引起疼痛。COX-2基因首先被报道与消化道肿瘤发生有关,随后的研究发现COX-2基因通过多种途径参与了多种实体性肿瘤和EMT的发生、发展。小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)技术是一项新近发展起来的基因治疗手段,因其可以特异性剔除或关闭基因的表达,它具备许多优势,比如价格低廉、方便快捷、效率高、稳定性强等,已成为探索基因功能的主要手段,在肿瘤和传染性疾病等的治疗方面已取得一定成果。该技术的建立和发展,无论是在理论上还是实践上都为EMT的治疗提供了一个全新的策略。目的利用si RNA介导的RNA干扰技术靶向沉默COX-2基因,观察对EMT在位、异位子宫内膜间质细胞(endometrial stroma cell,ESC)环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)、血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor,VEGF)和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)m RNA、蛋白表达及细胞凋亡的影响,探讨COX-2在EMT发病机制中的作用及si RNA靶向沉默COX-2基因用于治疗EMT的可行性。材料与方法1.研究对象选择2013年12月至2014年9月在河南省郑州大学第三附属医院(即河南省妇幼保健院)妇科行腹腔镜或开腹手术的患者70例,其中EMT在位、异位内膜组各30例,非EMT正常对照组10例(患其它妇科良性疾病,子宫内膜炎除外),年龄25-48岁(各组间年龄差异无统计学意义),术前3个月无激素使用史,诊断经腹腔镜、术后常规病理检查证实。所有标本的获取均经过患者知情同意。手术室中获取无菌标本后立即置于4℃预冷的含有双抗(青霉素、链霉素各100IU/ml)的无菌DMEM/F-12(FD)培养液中,1小时内送至实验室在生物安全柜中进行培养。2.试验方法(1)分离、培养EMT在位、异位ESC各30例,将在位、异位ESC分别分为3组(n=10):si RNA干扰组、阴性对照组和空白对照组,前两组分别注入COX-2si RNA转染复合物(含COX-2si RNA 150pmol和脂质体lip 2000 5ul)和阴性对照转染复合物(含阴性对照si RNA 150pmolul和脂质体lip 2000 5ul),同时分离、培养非EMT的正常ESC 10例作为正常对照组。(2)利用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应技术(Real time RT-PCR)检测转染前、后EMT在位、异位ESC和正常对照组ESC COX-2、VEGF及MMP-9基因m RNA的表达水平。转染后48h,采用上述方法筛选出一条抑制效率最佳的si RNA序列用于后续试验;(3)采用蛋白印迹法(Western Blotting)检测转染前、后内异症在位、异位ESC和正常对照组ESC COX-2、VEGF及MMP-9基因蛋白的表达水平。(4)转染后48h,采用流式细胞仪检测各组ESC的凋亡水平。结果1.分别培养内异症在位、异位ESC 35例、32例,最终均成功30例;10例正常子宫内膜间质细胞,均成功。2.3条COX-2 si RNA序列均有一定抑制效果,以si RNA-2抑制效率最佳。3.EMT在位、异位ESC空白对照组COX-2、VEGF、MMP-9 m RNA表达量均高于正常对照组(均P<0.05),且异位内膜组明显高于在位内膜组(P<0.05);靶向沉默COX-2基因后,干扰组在位、异位ESC COX-2、VEGF、MMP-9 m RNA表达量与阴性对照组和空白对照组相比,均降低(均P<0.05),而后两者间差异无统计学意义(均P>0.05),且异位内膜组较在位内膜组ESC COX-2、VEGF、MMP-9m RNA表达水平下降更明显(P<0.05)。4.EMT在位、异位ESC空白对照组COX-2、VEGF、MMP-9蛋白表达量均高于正常对照组(均P<0.05),且异位内膜组明显高于在位内膜组(P<0.05);靶向沉默COX-2基因后,干扰组在位、异位ESC COX-2、VEGF、MMP-9蛋白表达量与阴性对照组和空白对照组相比,均降低(均P<0.05),而后两者间差异无统计学意义(均P>0.05),且异位内膜组较在位内膜组ESC COX-2、VEGF、MMP-9蛋白表达水平下降更明显(P<0.05)。5.流式细胞仪检测结果显示,si RNA干扰组在位、异位ESC凋亡率较阴性对照组及空白对照组增加(均P<0.05),而后两者之间差异无统计学意义(均P>0.05),且异位内膜组较在位内膜组细胞凋亡更明显(P<0.05)。结论1.COX-2可能在EMT的发病机制中起重要作用。2.siRNA靶向沉默COX-2基因后,EMT促进因子VEGF、MMP-9的表达明显受到抑制,细胞凋亡水平明显增高。3.体外分离、培养原代ESC(在位内膜和异位内膜)是研究EMT的理想实验模型,si RNA技术为基因的靶向沉默提供了简单、有效的实验手段。4.si RNA靶向沉默COX-2基因能否成为治疗EMT的一种新型的可行性方法尚需进一步研究。
