大黄素抗人肝癌HCCLM3细胞的作用及相关机制的研究

一些中药对抗肿瘤具有作用范围广泛、毒副作用小的特点，它们能在肿瘤发生、发展过程的多个环节中起抑制作用，因此，利用中药治疗肿瘤成为国内外的研究热点。对中药治疗肿瘤的研究不仅需要证实其疗效，还要运用现代科学方法和手段揭示其抗肿瘤的机制。本研究所选用的大黄素是中药大黄的有效成分之一，目前研究表明它能抑制多种肿瘤细胞的增殖，包括乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结直肠癌等。本实验在总结前人研究的基础上，进一步研究其对肝癌HCCLM3细胞株的抑制作用以及可能涉及的作用机制。 目的：用不同浓度大黄素作用于肝癌HCCLM3细胞，观察细胞的生长、运动状态的改变，以及细胞内p53、Bcl-2、CD44、FAS、L-FABP、活性氧等分子的表达变化情况，探讨大黄素抗肝癌细胞的效果，以及所涉及的相关机制。 材料与方法：本实验选用人高转移性肝癌HCCLM3细胞株、人脐静脉血管内皮EVC-340细胞株、以及临床收集的原发性肝癌组织标本等作为研究对象。采用的方法主要有：1．采用MTT、流式细胞技术、免疫细胞化学染色技术以及共聚焦显象等方法来研究大黄素对细胞增殖与凋亡的作用；2．应用细胞粘附实验、Trans-well实验以及免疫学实验方法来研究大黄素对细胞粘附与侵袭的作用；3．通过半定量RT-PCR、免疫化学染色以及Western-blot等方法来研究脂肪酸代谢通路中主要的作用分子的表达改变；4．采用SPSS13．0统计软件进行统计学分析。 结果：1．MTT法检测结果显示不同浓度实验组（80、60、40、20μmol／L）在不同时间对HCCLM3细胞增殖具有一定的抑制作用，并呈现一定的剂量效应和时间效应关系；HCCLM3细胞核凋亡的形态学改变；与对照组相比，随着药物浓度的升高，p53的表达显著性降低；Bcl-2的表达显著性降低，胞内活性氧含量显著性升高（P＜0．05）。2．细胞之间以及细胞与内皮细胞之间的粘附性，随着大黄素作用剂量的升高抑制粘附的效果愈显著，与对照组相比以及不同药物剂量实验组之间比较差异有统计学意义（P＜0．05）；侵袭实验结果显示大黄素作用后穿过Matrigel膜的细胞明显减少，差异有显著意义（P＜0．05）；免疫学实验结果显示致敏的细胞毒T淋细胞以及自然杀伤细胞在大黄素的作用下可以增强其杀细胞的作用。3．半定量RT-PCR、免疫组织化学以及半定量Western blot的结果均显示，FAS与L-FABP在原发性肝癌中的表达较癌旁组织显著增强P＜0．05；大黄素作用后肝癌细胞内，FAS与L-FABP表达下降P＜0．05。 结论：1．大黄素可以抑制人肝癌HCCLM3增殖，诱导人肝癌HCCLM3细胞凋亡。其机制可能是阻滞细胞G2／M期，下调Bcl-2，增强p53蛋白的表达以及增加细胞内活性氧的水平而诱导细胞凋亡。 2．大黄素可以减弱细胞与细胞，细胞与基质之间的粘附作用，减弱细胞的穿透性能与运动性能，另外还可以通过增强外周单核细胞介导的特异性与非特异性免疫反应来阻止癌细胞逃避机体的免疫作用，所有结果表明大黄素具有显著的抗肿瘤侵袭、转移作用。 3．FAS与L-FABP在肝癌细胞内明显增高，它的过度表达提示肝癌细胞合成以及转运内源性脂肪酸的能力增强，大黄素作用后，细胞内FAS与L-FABP的表达较作用前有所下调，表明大黄素可以抑制HCCLM3细胞的脂肪酸代谢，进而抑制HCCLM3的增殖。