2010年全球疾病负担报告(Global Burden of Disease,GBD)显示,卒中位居死因顺位第二位,2004-2005年我国全国第三次死因回顾抽样调查报告显示,脑血管病升为第一位死因,2010年疾病负担报告显示脑血管病死因仍居第一位。其中,缺血性卒中年龄标化发病率要远高于出血性卒中。深入研究缺血性脑卒中的发病机制和治疗,具有重要的医学价值。胶质细胞是神经系统内的一大类细胞,约占中枢神经系统细胞总数的90%,除了具有支撑,提供营养及协助代谢等辅助作用,同时具有兴奋性,参与神经元的通讯并促进突触形成和神经再生等功能。在急性脑缺血发生时,星形胶质细胞最先受到损伤,受损的胶质细胞会杀死邻近的神经元,并且受损的星形胶质细胞会发生凋亡,之后导致神经元的二次损伤,最终使脑梗死面积扩大。在缺氧条件下,缺氧诱导因子-1((hypoxia inducible factor-1,HIF-1)可直接或间接调控100多种下游靶基因的转录而成为低氧应答时稳定细胞内环境的调节中心。HIF-1由稳定表达的HIF-1β亚基和受低氧调控的HIF-1α亚基组成。缺氧状态下,HIF-1α广泛表达于脑组织,包括神经元,神经胶质细胞及血管内皮细胞等,其对脑缺血具有双重作用。当轻度缺血缺氧时,HIF-1α可激活其下游基因,通过增加血管生成、调节糖酵解等方式减少细胞凋亡。严重缺血缺氧状态下,HIF-1α可通过与p53结合诱导细胞凋亡,或诱导bcl2(B-cell lymphoma 2)家族中的凋亡前基因BNIP3(BCL2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein3)表达等途径诱导细胞凋亡。缺氧条件下HIF-1与BNIP3基因启动子的缺氧反应元件(hypoxia-response element,HRE)序列结合,从而促进BNIP3表达,而BNIP3能通过促进H+内流或细胞色素C的释放等方式来促进凋亡。清脑滴丸(又名清脑宣窍滴丸)是经过长期临床实践总结的方剂,治疗缺血性脑中风急性期和恢复早期均有很好的疗效。此方由栀子、三七和冰片三味药物组成,三药共奏清热泻火、活血宣窍之功效,临床研究报道,清脑滴丸对改善中医证候方面尤其是对"善忘迟钝、头痛、眩晕、口苦咽干、大便秘结、舌苔黄"火热、血瘀症状有明显改善作用,可改善患者神经功能缺损程度。实验研究发现清脑滴丸可通过减轻酸中毒,抑制自由基产生和粘附分子表达等来调控脑缺血再灌注损伤的代谢紊乱,抑制JNK磷酸化蛋白过表达来降低细胞凋亡,减轻脑损伤。[研究目的]从HIF-lα调控细胞凋亡探讨清脑滴丸对大鼠脑缺血再灌注损伤和C6胶质细胞氧糖剥夺损伤中的作用,阐释清脑滴丸保护脑缺血再灌注损伤的分子机制。[研究方法]1、体外培养大鼠C6胶质细胞,采用氧糖剥夺/复氧的方法建立细胞损伤模型。细胞氧糖剥夺24h后,分别复氧复糖Oh、3h、6h,同时给予不同浓度的清脑滴丸(0.625 g/L、QNDW 1.25g/L),CCK8法测定细胞活力,筛选最佳时效点和最佳量效。Western Blot法观察各组HIF-1α、BNIP3、Caspase-3蛋白表达情况,免疫荧光染色法观察各组HIF-1α、Caspase-3的表达情况。2、线栓法制备大鼠左侧大脑中动脉脑缺血再灌注损伤模型,Garcia GH法和TTC染色检测大鼠神经功能缺损程度及脑梗死体积,Western Blot法检测缺血侧皮层HIF-1α、BNIP3、Caspase-3蛋白表达情况,荧光染色法检测HIF-1α、GFAP的表达情况。[研究结果]1、细胞实验①与相应的正常组相比,氧糖剥夺24h复氧3h、6h组细胞活力(P<0.01);其中氧糖剥夺24h/复氧6h细胞活力最低,且损伤细胞约50%,因此确定时间点为氧糖剥夺24h/复氧6h。②与氧糖剥夺24h/复氧6h模型组相比,清脑滴丸0.625 g/L浓度组、清脑滴丸1.25g/L浓度组细胞活力均明显上升(P<0.05),其中,清脑滴丸1.25g/L浓度组细胞活力最高。③Western Blot法检测结果:与正常组相比,氧糖剥夺24h/复氧6h组细胞HIF-1 α、BNIP3、Caspase-3蛋白表达都增加(P<0.05);与氧糖剥夺24h/复氧6h组相比,清脑滴丸1.25g/L浓度组细胞HIF-1α、BNIP3、Caspase-3蛋白表达都降低(P<0.05)。④免疫荧光染色检测结果:与正常组相比,氧糖剥夺24h/复氧6h组HIF-1α、Caspase-3表达显著增加(P<0.05);与氧糖剥夺24h/复氧6h组相比,清脑滴丸1.25g/L浓度组HIF-1α、Caspase-3 表达显著降低(p<0.05)。2、动物实验①与假手术组相比,脑缺血1.5h再灌注24h组脑梗死面积增加(P<0.05),神经功能缺损评分降低(P<0.01);与脑缺血1.5h再灌注24h组相比,清脑滴丸组和HIF-1α抑制剂组脑梗死面积都降低(P<0.05),神经功能缺损评分都增加(P<0.01)。②Western Blot法检测结果:与假手术组相比,脑缺血1.5h再灌注24h组中HIF-1 α、BNIP3、Caspase-3蛋白表达都增加(P<0.05);与脑缺血1.5h再灌注24h组相比,清脑滴丸组和HIF-1 α抑制剂组中HIF-1 α、BNIP3、Caspase-3表达都降低(P<0.05),清脑滴丸组明显降低HIF-1α、BNIP3、Caspase-3蛋白过表达。③免疫荧光染色检测结果:HIF-1α与GFAP可共表达于细胞中,即HIF-1α可表达于星型胶质细胞中。与正常组相比,脑缺血1.5h再灌注24h组HIF-1α表达显著增加(P<0.05);与脑缺血1.5h再灌注24h组相比,清脑滴丸组和HIF-1 α抑制剂组HIF-1α表达显著降低(P<0.05)。[结论]清脑滴丸可通过抑制脑缺血再灌注凋亡而发挥保护作用,其机制可能与通过下调脑缺血再灌注损伤大鼠和C6胶质细胞的HIF-1α的过表达,降低BNIP3和Caspase-3蛋白表达有关。本研究的创新点从HIF1a与细胞凋亡角度,在组织、细胞、分子水平阐释了清脑滴丸对脑缺血再灌注损伤的保护机制,为临床用药提供了科学依据。
