温度胁迫下番茄叶绿体谷胱甘肽还原酶基因的克隆、表达和功能分析

低温是限制冷敏感植物产量和地理分布的重要因素。在正常生长条件下,植物细胞的多种代谢反应均会产生活性氧(reactive oxygen species, ROS)。而低温、高温、盐渍、干旱、臭氧等胁迫则可导致ROS大量产生,若未及时清除,ROS便会攻击蛋白质、核酸、脂类等生物大分子引起氧化损伤,进而导致细胞及组织死亡。植物叶绿体是ROS产生的主要部位之一,环境胁迫下叶绿体内产生的ROS的快速清除有助于保护光合机构,维持植物光合功能。谷胱甘肽(glutathione, GSH)是叶绿体活性氧清除系统的关键组分,GSH既可以直接与ROS反应将其还原,又可以作为底物参与酶促反应以清除活性氧。谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase, GR)维持着GSH较高的还原型/氧化型的比率,这对于清除细胞内ROS至关重要。因此,研究GR基因与植物抗逆性的关系具有重要意义。 本研究从番茄叶片中克隆了叶绿体谷胱甘肽还原酶基因(LeGR),并对该基因的表达和功能进行了分析。 1.利用同源序列设计兼并引物,通过RT-PCR的方法从番茄叶片克隆到叶绿体GR基因的中间片段,通过5’-RACE和3’-RACE分别克隆到5’片段和3’片段,拼接后设计特异引物扩增到全长cDNA。命名为LeGR(EU285581)。该基因全长为2229 bp,ORF为1674 bp,编码557个氨基酸,分子量约为59 kDa。同源序列比较表明,番茄谷胱甘肽还原酶基因的序列与烟草、拟南芥、水稻、豌豆、油菜的谷胱甘肽还原酶基因的序列同源性较高。 2.将p35S-LeGR-GFP融合蛋白在拟南芥原生质体中瞬时表达。通过Confocal观察到GFP激发的绿色荧光和叶绿素的红色自发荧光完全重合,说明LeGR基因产物定位于叶绿体。 3. Northern杂交分析表明,LeGR基因在叶绿素含量高的组织中表达量较高。同时该基因的表达受低温、高温胁迫诱导,其表达水平随胁迫处理时间的延长而变化。 4. LeGR基因组序列全长6672bp,共有10个exon。Southern杂交结果表明, LeGR在番茄基因组中只有一个拷贝。 5.将获得的LeGR基因与含有35S启动子的pBI121载体重组,分别构建了正义和反义表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法转化番茄,用PCR及Northern杂交的方法对带卡那抗性的转基因番茄植株进一步检测,结果证明成功地获得了转正义和反义基因的番茄植株。与野生型相比,转反义LeGR基因的番茄叶片GR活性下降约60%。 6.构建了原核表达载体pET-LeGR,并在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白,将诱导带切下,溶于PBS获得抗原,免疫小白鼠,其抗血清效价为1: 500。Western杂交表明,反义基因植株中LeGR基因在蛋白水平的表达明显受到抑制。 7.在低温弱光(4℃,100μmol m-2 s-1)和高温(40℃)胁迫条件下,野生型和转基因株系的净光合速率(Pn)和PSII最大光化学效率(Fv/Fm)下降,但与野生型相比,转反义基因株系T1(-2)T1-5和T1-9的下降更为明显。这表明抑制LeGR的表达加剧了PSII的光抑制。在低温弱光处理过程中,转基因植株与野生型的氧化态P700降低,恢复24 h后,转反义基因三个株系分别恢复到原来的70.2%、72.9%和69.8%。经过24 h处理,转基因和野生型的H2O2和丙二醛含量均增加,转反义基因植株显著高于野生型。 8.正常生长条件下,野生型与转反义基因幼苗生长量无明显差别。但是,温度胁迫条件下,转反义基因幼苗生长明显受到抑制,且叶绿素含量显著下降。 9.转基因植株中GR活性明显降低,抑制了谷胱甘肽循环周转,导致GSH/GSSG比率降低,但谷胱甘肽总量不变;谷胱甘肽循环周转的降低导致抗坏血酸周转受到抑制,AsA/DHA比率降低,且抗坏血酸总量明显降低。AsA-Glu循环受阻导致的H2O2积累是光抑制和冷敏感性增加的主要原因。另外,APX和SOD活性受到直接或间接的影响,进一步加剧了光抑制。