构树遗传多样性的AFLP研究

构树(Broussonetia papyrifera)主要分布于我国的西北、华北、华南、东南及西南各地,构树适应性广,萌芽力强,易繁殖,是路旁绿化与防堤护岸的重要树种。其树皮、木材、枝桠、叶、花、果实、种子、根、乳汁等皆可综合利用,经济效益潜力很大。构树属植物近20年来广受国内外学者的关注。 AFLP(扩增长度片段多态性)是一种新的DNA分子标记技术,以其稳定性好、重复性高、覆盖面广、多态检出率高等优点被迅速且广泛地运用于生命科学的各领域中。本研究首次采用AFLP分子标记技术研究构树种质资源遗传多样性、遗传结构及群体间的相互关系,并结合分布区的生境状况,探讨其遗传多样性和遗传分化的影响因素,为构树基因资源引进、评价、保存及遗传改良提供科学依据。主要结论如下: (1)本研究采用云南省内的296个构树种质为材料。通过对常规SDS法、常规CTAB法、SDS-CTAB结合法、改良CTAB和改良SDS法等多种提取方法对构树总DNA的提取效果进行比较研究,确定了改良SDS法较为适合构树基因组DNA的提取。此法提取的DNA其OD260/OD280值在1.8-2.0之间,且能被EcoRI和MseI酶切完全,并能获得清晰AFLP指纹图谱。此DNA提取方法快速、高效、经济,提取的DNA质量好,特别对样品数量多、工作量大等情况下的研究尤为适用。 (2)通过对影响AFLP技术体系的各主要因素的研究,建立起适合构树的AFLP分析的技术体系:酶切体系30μL,总体积中含纯化后的DNA 4μL;EcoRI和MseI各5U,分步进行酶切;酶切完成后加入连接液,37℃连接过夜(10-12h);预扩增产物稀释40倍用于选择性扩增;扩增产物加入4μL的双指示剂,95℃变性5min后,在6%变性聚丙烯酰胺上恒功率(95W)进行电泳,然后进行银染显色。 (3)从64对EcoRI /MseI引物中筛选出13对清晰、多态性高的引物,对296个构树材料的遗传多样性进行了AFLP分析,都得到了清晰的指纹图谱,并且表现出较好的多态性。利用7对引物对不同水系与不同家系的构树遗传多样性进行了研究,7对引物共扩增出786条带,平均每对引物扩增112.3条带,多态性条带632条,占总带数的80.4%。扩增片段大小在50-450bp之间。多态性最高的为引物组合E64/M54,高达86.4%,最低的是E40/M34,多态性为75.9%。利用6对引物对不同类型构树遗传多样性进行了研究,6对引物共扩增出831条带,平均每对引物扩增138.5条带,多态性条带610条,占总带数的73.4%。扩增片段大小在80-500bp之间。多态性最高的为引物组合E64/M54,高达86.4%,最低的是E44/M60,多态性为67.1%。揭示了构树种质具有丰富的遗传多样性。 (4)对指纹图谱进行判读,构建0、1数学矩阵。利用POPGENE32 version 1.32软件计算遗传多样性指数,采用NTSYS.pc2.11f计算软件,得到相似性系数矩阵,并基于Nei’s遗传距离采用UPGMA法进行聚类分析。 (5)在构树不同层次遗传多样性比较中,不同类型的遗传多样性最高,h=0.1706;而不同水系的遗传多样性最低,h=0.1328。居群内的遗传变异远高于居群间的遗传变异,居群间分化程度低。并且不同层次的基因流值都大于2,说明基因交流防止了由遗传漂变等引起的居群间的遗传分化。 (6) 4个水系的遗传距离分析表明,以元江水系和金沙江水系之间的遗传距离最大(0.0098),元江水系与怒江水系、红河水系之间的遗传距离最小(0.0055)。从聚类图上可以看出,在遗传距离为0.003处取一结合线,可以将4个水系分为2大类,第一类包括元江水系、怒江水系和红河水系;第二类为金沙江水系。 (7) 10个家系的遗传距离分析表明,以石屏家系I和江川家系之间的遗传距离最大(0.0373),四川家系I和四川家系II遗传距离最小(0.0030)。从聚类图上可以看出,在遗传距离为0.008处取一结合线,可以将10个家系分为2大类,第一个类包括怒江家系I,怒江家系II,怒江家系III,石屏家系I,石屏家系II,建水家系I;第二个类包括建水家系II,四川家系I,四川家系II,江川家系。 (8) 4个构树类型的遗传距离分析表明,以青构和白花构之间的遗传距离最大(0.0296),红构和白花构遗传距离最小(0.0087)。从聚类图上可以看出,在遗传距离为0.006处取一结合线,可以将4个构树分为2大类,第一类包括红花构和青构;第二类包括红构和白花构。