淫羊藿甙对MC3T3-E1细胞Smad1，4，5作用的实验研究

目的：研究淫羊藿甙(icariin, ICA)对体外培养的成骨样细胞MC3T3-E1中Smad1,4,5mRNA及蛋白的影响,探讨ICA刺激成骨细胞生长、分化的分子机制。 方法：DMEM高糖、胎牛血清培养下的MC3T3-E1细胞按ICA刺激浓度0、10-9、10-8及10-7M分为四组,以1×105个／孔浓度种植。给药后24、48及72h分别检测细胞OD值；RT-PCR技术测定Smad1、Smad4、Smad5mRNA的量,用Western blot蛋白印迹方法评价Smad1、Smad4、Smad5蛋白的表达；利用速率法测定ALP活性,计算ALP浓度；经ICA刺激的MC3T3-E1细胞培养21d后,利用Von Kossa's矿化结节染色法处理各浓度组,观察染色结果。 结果：24hrs时,ICA各浓度组Smad1、Smad4、Smad5mRNA表达水平无统计学意义,P值>0.05(Smadl:F=0.064, P=0.961; Smad5:F=1.216, P=0.351,; Smad4:F=0.051,P=0.022).48,72hrs时,ICA10-9M、10-8M、10-7M浓度组Smad1、 Smad5mRNA表达水平较0M组明显上调,P值<0.05,具有统计学意义(48hrs: Smad1, F=332.435, P=0.000; Smad5, F=373.487, P=0.000;72hrs:Smad1, F=132.356, P=0.000; Smad5, F=102.384, P=0.000)。而smad4在48h时,各浓度组均较24h时表达增强,并且在10-8M时差异明显,具有统计学意义(F=131.654,P=0.000)。至72hrs时,ICA10-9、10-8、10-7M各组,以10-8M组对Smad1、Smad4、Smad5mRNA的上调作用最为显著(P值均<0.05,图表2-c、3-c)。Western blot蛋白印迹显示24、48hrs时,ICA各浓度组Smad1蛋白表达水平无统计学意义,P值>0.05(24hrs:F=0.749, P=0.559;48hrs:F=2.653, P=0.136),72hrs时,ICA10-9、10-8、10-7M各组蛋白表达水平较0M组明显增加,P值<0.05(F=16.985,P=0.001),具有统计学意义；Smad5蛋白表达在ICA10-9、10-8、10-7M组分别于24、48、72hrs发现均较0M组上调,其中48hrs、72hrs表达增量明显,P值<0.05,具有统计学意义(24hrs:F=3.762, P=0.060;48hrs:F=14.579, P=0.001;72hrs:F=27.762, P=0.000);ICA有效刺激组较对照组Smad5蛋白的表达于24hr时即出现差异性,Smad1及Smad4表达的差异性出现于72hrs,相对于48hrs以后出现表达差异的Smad1mRNA、Smad4mRNA、Smad5mRNA而言,蛋白的表达并非平行于Smad1、Smad4、Smad5基因的表达,提示ICA对Smad1、4及5信号的转录后水平的调控；至72hrs时,ICA10-9、10-8、10-7M各组,以10-8M组对Smad1、Smad4、Smad5蛋白的上调作用最为显著(P值均<0.05)。细胞ALP活性检测结果显示MC3T3-E1细胞在淫羊藿甙的刺激下产生ALP的时间依赖性：各组在培养后的3d内,随着时间的增加,LAP产生的总量增加。培养1d时,各组ALP值之间比较差异无统计学意义；培养2d时,10-9、10-8M组ALP值明显高于0、10-7M组(P<0.01).10-9、10-8M组间、0、10-7M组间比较差异无统计学意义(P>0.5).培养3d时,各组ALP值由高到低排列依次为10-8、10-9、0、10-7M.各组均值之间比较差异有统计学意义(P<0.01).ICA对MC3T3-E1细胞钙结节检测的染色结果显示,细胞在淫羊藿甙刺激下培养21d后,Von Kossa's矿化结节染色法处理各浓度组细胞,钙结节增加从高到低依次为10-8、10-9、0、10-7M。 结论：ICA可能通过上调Smad1,4,5mRNA及蛋白的表达来促进成骨细胞分化。