中药是典型的复杂体系,对其的质量控制也是中药现代化的瓶颈之一,中药质量控制要体现中药整体、辩证的特点。多成分含量测定能够严格的控制中药中有效成分或指标性成分的含量,而指纹图谱则用代表中药物质基础的化合物群所表征的指纹图谱来综合评价中药质量,符合中药模糊的特征,能更全面的反应中药质量。在此过程中,采用HPLC-TOF等现代分析联用技术对指纹图谱中的色谱峰进行精确表征可以让我们更好的了解中药的药效物质基础和进行机理研究。中药体内动力学过程研究也为我们认识中药的作用机理提供了视角,为阐明中药的组方原理、作用机制都具有很好的指导作用。
本课题建立了牡丹皮中的三种主要有效成分没食子酸、芍药苷和丹皮酚的HPLC-DAD含量测定方法,系统考察了影响提取效率的提取溶剂、提取时间、提取次数等因素,最后确定超声提取20min,线性范围分别为4.004 ~ 100.1μg/ml;20.6 ~ 515.0μg/ml;33.28 ~ 832.0μg/ml。平均回收率分别为100.7%、99.2%、97.8%;RSD分别为1.6%、3.0%、1.1%,方法准确可靠,并应用到16批牡丹皮药材的测定,同时建立了牡丹皮药材的指纹图谱,共匹配出17个共有峰,并对药材进行相似度评价,了解药材间的质量差异,结果显示药材质量差异不明显,多成分含量测定与指纹图谱相结合的方法使得牡丹皮的质量控制更全面、可靠。随后我们采用主成分分析和聚类分析对药材进行了更细致的研究,在分析过程中,主成分分析和聚类分析可以相互印证,增加结果的可信度,结果显示牡丹皮在主成分和聚类分析中都明显被聚为四类,其中山东和河北产牡丹皮聚成一类,而安徽产牡丹皮则和浙江聚成一类,显示出一定的地域相关性,为牡丹皮质量一致性和道地性研究提供依据。
采用HPLC-TOF/MS和GC-MS对牡丹皮药材中的成分进行定性鉴别。通过比对数据库,在HPLC-TOF/MS研究中共鉴别出21中化合物,实验中分别采集了牡丹皮提取物的正、负离子流图,并对其中的两对同分异构体进行了鉴别。在此基础上对指纹图谱中色谱峰进行指认,指认出17个共有峰中的14个,对牡丹皮指纹图谱进行明晰化,为更好的评价指纹图图谱的代表性以及阐明牡丹皮质量差异的来源提供了手段。指纹图谱中14个共有峰绝大部分为牡丹皮中特有的芍药苷和芍药醇类物质,表明具有较强的代表性。对牡丹皮中挥发油成分和乙醚提取物成分采用GC-MS进行分析鉴别与定性研究,由于GC-MS联用仪配有EI离子源,EI离子源所得质谱图具有重现性高,有相应的化学成分数据库等特点,可借助计算机检索与质谱数据库自动匹配进行鉴别分析,实验中共成功鉴别出牡丹皮中32个成分,更全面的了解牡丹皮中的化学成分,为其后续质量控制提供基础。
建立HPLC-MS方法测定大鼠血浆中芍药苷含量,芍药苷在0.0412μg/ml 10.30μg/ml浓度范围内呈良好的线性关系,芍药苷低、中、高三个浓度的相对回收率均在95.0%～105%之间,日内和日间精密度相对标准差均小于6.0%;稳定性实验结果表明,芍药苷在4℃贮存4天内稳定,常温12h稳定性良好。在给定的方法下,血浆中芍药苷的定量限为0.0412μg/ml,血浆中内源性物质均不干扰样品峰,含量测定方法简便可靠,适合于生物样品成分的含量测定。该方法成功应用于SD大鼠口服给药芍药苷纯品,牡丹皮提取物和复方（牡丹皮和丹参）提取物后的药代动力学研究。结果显示口服芍药苷纯品和药材提取物后芍药苷在大鼠体内的药动学行为存在显著差异,包括AUC0-t,AUC0-∞,MRT,T1/2在内的药动学参数在口服药材提取物之后显著提高,表明生物利用度的提高,从药代动力学的角度阐明了中药的优越性以及中药作用的整体性,中药质量控制必须从整体出发。从药动学结果推测芍药苷生物利用度的提供可能与牡丹皮的抗菌作用有关,而丹皮酚为牡丹皮中抗菌作用的主要成分,提示牡丹皮的质量控制需要对丹皮酚也进行控制,为牡丹皮质量控制的有效成分选择提供依据,并为进一步的药理研究提供借鉴。
