高脂诱导的氧化应激对小鼠肠道菌群改变与炎症反应的影响

肠道菌群与肥胖等代谢综合征发生、发展有着密切的联系，但是高脂膳食调节肠道菌群及影响炎性反应的机制仍然不清楚。研究显示，高脂膳食能够引起机体氧化应激水平升高，尤其是引起肠道的氧化应激。而肠道是共生菌群栖息的环境，又由于不同的菌群氧化应激耐受性存在很大差异。因此，我们提出假设高脂膳食通过调节机体氧化还原状态从而影响肠腔菌群结构组成，使进入派伊尔结的内生菌群结构发生改变，诱导肠道炎性细胞因子的产生，最终引起全身性炎症反应及代谢综合征的发生。 首先，高脂膳食诱导小鼠产生氧化应激模型及硫辛酸（LA）干预调节，来研究肠道氧化还原状态对菌群结构的影响。通过检测结肠，结肠内容物自由基（ROS）、丙二醛（MDA）、总抗（T-AOC）水平评价肠道氧化还原状态；采用变性梯度凝胶电泳（DGGE）及平板计数分析肠道菌群结构和数量。高脂膳食导致结肠，结肠内容物中ROS、MDA显著上升，T-AOC水平显著下降，添加LA后，能显著降低高脂膳食引起的氧化应激。DGGE结果显示，高脂膳食导致肠道菌群结构紊乱，出现高脂组特异性菌群，并且大肠杆菌、粪球菌数量显著增加，乳酸菌数量显著降低（P<0.05）。LA处理后，菌群结构有所改善，大肠杆菌、粪球菌数量显著下降，乳酸菌数量显著增加。相关性分析显示，ROS、MDA水平与大肠杆菌、粪球菌数量显著正相关（P<0.05），与乳酸菌显著负相关（P<0.05）。T-AOC与乳酸菌显著正相关，但与大肠杆菌、粪球菌显著负相关（P<0.05）。 高脂膳食建立肥胖易感和肥胖抵抗两种模型，及白藜芦醇（RES）干预进一步评价氧化应激与肠道菌群间的关系。采用荧光原位杂交（FISH）与流式细胞相结合的方法分析肠道菌群，并对结肠炎性基因表达情况进行评价。结果显示，氧化应激水平：肥胖易感组>肥胖抵抗组>正常组，添加RES后，能显著降低各组氧化应激水平。FISH及主成分分析显示正常组、肥胖易感组、肥胖抵抗组三组肠道菌群存在显著差异。肥胖易感组乳酸菌、双歧杆菌数量显著下降，肠杆菌属数量显著上升。拟杆菌与硬壁菌的比值：肥胖易感组<肥胖抵抗组<正常组，添加RES后，乳酸菌、双歧杆菌数量显著上升，肠杆菌属数量显著下降，拟杆菌与硬壁菌的比值显著改善。相关性分析显示，拟杆菌与硬壁菌门的比值与ROS、MDA显著负相关（P<0.05），与T-AOC显著正相关（P<0.05）。肥胖易感组能显著增强NOD2和CARD9的表达，并选择性地激活转录因子NF-κB，增强IL-8、IL-10、TNF-α、IL-23等细胞因子的分泌，引起机体严重炎症反应。 研究高脂膳食诱导的肥胖易感和肥胖抵抗型小鼠派伊尔结内生菌群结构组成，及其对肠道炎症的影响。结果发现，与正常组和肥胖抵抗组相比，肥胖易感组派伊尔结内生菌群丰度及多样性显著下降（P<0.05）。正常组、肥胖抵抗组、肥胖易感组派伊尔结内生菌群种属水平上差异显著，表现为：肥胖易感组乳球菌属（Lactococcus）、根瘤菌属（Rhizobium）丰度显著升高（P<0.05），而Allobaculum和乳杆菌属（Lactobacillus）丰度显著下降（P<0.05）。另外，还有一些内生菌属，如链球菌属（Streptococcus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、从毛单胞菌属（Comamonas）和黄杆菌属（Flavobacterium），高脂膳食后，无论是肥胖易感组还是肥胖抵抗组都显著增加。另外，肥胖易感型小鼠显著上调派伊尔结炎性细胞因子IL-6、TNF-α、INF-γ及IL-12的表达，其中IL-6、TNF-α与乳球菌属、根瘤菌属等呈显著正相关，显著抑制抗炎性细胞因子IL-10及TGF-β的表达（P<0.05），其中IL-10与Allobaculum属及乳杆菌属呈显著正相关。 对派伊尔结内生乳杆菌结构组成及其体外抗氧化特性进行研究。平板培养分离得到的92株乳杆菌经ERIC-PCR分型后，共得到13种不同的图谱，主要分属于罗伊乳杆菌等五个种，其中罗伊乳杆菌得到8株。体外抗氧化实验结果显示，肥胖易感组氧化应激耐受性弱的罗伊乳杆菌数量显著下降，氧化应激耐受性强的罗伊乳杆菌数量增加。其中Lactobacillus reuteri L8氧化应激耐受性最强，只存在于高脂组，为高脂组特异罗伊乳杆菌，而Lactobacillus reuteri L3氧化应激耐受性最弱，高脂组中消失，为正常组特异罗伊乳杆菌。并且L3能够促进派伊尔结抗炎性细胞因子IL-10的产生，抑制炎性细胞因子IL-6、IL-12、TNF-α的产生，而且对LPS损伤的派伊尔结细胞有保护作用。 最后，研究两株组特异性Lactobacillus reuteri L3和L8对机体代谢的影响。结果显示，高脂组灌胃Lactobacillus reuteri L3，能显著抑制高脂膳食引起的体重、血糖、血胰岛素水平的增加，但此效果与抑制食物摄入量无关。高脂组灌胃Lactobacillus reuteri L3后，能显著降低血LPS及炎性细胞因子的水平，而促进抗炎性细胞因子的分泌，另外，灌胃Lactobacillus reuteri L3后，通过下调肝脏中LPL及Scd1表达，上调Cyp7a1基因表达，促进肝脏组织中脂肪酸分解，并通过下调脂肪组织中PPAR-γ、ACC1和Fas的表达情况，抑制脂肪组织中脂肪酸合成。但高脂灌胃Lactobacillus reuteri L8后，对高脂膳食的改善效果不显著。 综上所述，高脂膳食通过诱导氧化应激导致肠道菌群结构紊乱，使进入派伊尔结的内生菌群结构发生改变，诱导肠炎性细胞因子的产生，并通过血液内毒素等引起机体炎症，最终导致肥胖等代谢综合征的发生。