当归挥发油干预大鼠LPS炎症模型的相关代谢物及代谢通路分析

代谢组学技术的发展为中国传统兽医药学的现代化研究提供了一种选择，将代谢组学技术应用到中兽药药效评价方面具有广阔的前景。本论文以当归挥发油为研究对象，气相-质谱联用（GC-MS）为分析技术，建立了甘肃道地药材当归挥发油化学成分指纹图谱；在此基础上，建立大鼠炎症模型并利用当归挥发油进行干预，采用代谢组学研究策略，进行了当归挥发油的抗炎机制研究，从机体整体水平揭示其抗炎的机理；将整合化的策略应用到研究中，分析了当归挥发油抗炎相关的代谢物、代谢通路以及与当归挥发油抗炎作用相关的细胞因子之间的关系，为甘肃道地药材当归的开发利用、诠释当归挥发油抗炎机制提供了基础研究资料，而且为解决中药的整体效应和物质基础提供新思路和新方法。主要研究结果如下： 1.采用水蒸汽蒸馏法和有机溶剂石油醚提取当归挥发油，使用GC-MS测定了其主要化学组成。主要化学成分为Z-藁本内酯、罗汉柏烯、-雪松烯、2-甲氧基苯酚、(+)-香橙烯、-甜没药烯、(-)-匙叶桉油烯醇、Z-丁烯基酞内酯、E-藳本内酯等。对甘肃15个采样地的当归挥发油GC-MS检测结果进行相似度评价和主成分分析，结果表明相似度均大于0.900，甘肃不同地区的当归挥发油化学成分之间没用明显的差异。 2.采用腹腔注射脂多糖（LPS，100μg/kg），建立大鼠LPS炎症模型。给予当归挥发油低剂量组（OVASL，0.088g/kg）、当归挥发油中剂量组（OVASM，0.176g/kg）、当归挥发油高剂量组（OVASH，0.352g/kg）干预，阳性对照地塞米松（Dex）、空白对照组（KB）。LPS注射8h后，取血液测定血常规，分离血清测定生化指标及相关细胞因子、炎性介质，分离血浆、接取尿液、取肺组织、肝组织用于GC-MS代谢组学分析。当归挥发油各剂量组均可以降低大鼠LPS炎症模型组白细胞（WBC）、谷草转氨酶（GOT）、谷丙转氨酶（GPT）、碱性磷酸酶测定（ALP），显示当归挥发油能有效地抑制大鼠体内的炎症症状和对大鼠的肝脏损伤有一定保护作用，减少了LPS对其伤害。当归挥发油的抗炎机制可能是抑制LPS诱导的巨噬细胞分泌炎症介质一氧化氮（NO）和促炎细胞因子肿瘤坏死因子α （TNF-α）、白介素6（IL-6）、白介素1β （IL-lβ）、白介素8（IL-8），促进抗炎细胞因子白介素（IL-10）分泌，以及抑制组胺（HIS）、5-羟色胺（5-HT）炎性介质的释放，其中OVASM效果最好。 3.采用GC-MS测定空白对照组（KB）、LPS炎症模型组、Dex、OVASL、OVASM、OVASH各组血浆、肝组织、肺组织、尿液中代谢物，分别鉴定和推测出72、70、66、80种代谢物。应用主成分分析（PCA）、偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）对各组血浆、肝组织、肺组织、尿液GC-MS数据进行分析，发现KB、LPS炎症模型组得到完全分离，Dex、OVASL、OVASM、OVASH靠近对照组，表明炎症模型复制成功，且Dex、OVASL、OVASM、OVASH能够干预大鼠的炎症反应，表现恢复到正常状态的趋势。通过重要变量投影因子（VIP）及非参数检验筛选出血浆、肝组织、肺组织、尿液中的差异代谢物，其中OVASM表现出潜在的药理效应，调节多个差异代谢物到正常状态。运用代谢组学途径分析（Metabolomics PathwayAnalysis, MetPA）数据库对差异代谢物的代谢途径进行分析。 （1）血浆中筛选出32种差异代谢物，这些差异代谢物与脂肪酸代谢、糖酵解、甘氨酸、尿素代谢有关，提示当归挥发油抗炎作用可能是通过调节血浆中尿素含量，使蛋白质的合成恢复；增加血浆中甘氨酸，发挥直接作用靶细胞或间接调节炎症因子起到细胞保护作用，从而缓解炎症反应；恢复脂类代谢紊乱，肝X受体表达上调，以发挥抗炎作用。 （2）肝组织中筛选出23种差异代谢物，这些差异代谢物与亚油酸代谢、半乳糖代谢、甘油酯代谢和花生四烯酸（AA）代谢有重要的相关性，提示当归挥发油抗炎作用可能是通过降低肝脏中游离脂肪酸和甘油的含量，以减少炎性因子的释放和促进抗炎因子释放；提高半乳糖的含量，使肝脏中半乳糖的代谢正常。 （3）肺组织中筛选出27差异代谢物，这些差异代谢物与谷氨酸盐和谷氨酸酯代谢、亚油酸代谢、-亚麻酸的代谢、半乳糖代谢、花生四烯酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、戊醣酸途径；磷酸戊糖途径及甘油酯等代谢通路有重要的相关性，提示当归挥发油抗炎作用可能是通过恢复谷氨酸的生成以阻滞琥珀酸的积聚从而减少炎症因子的释放；减少肺组织匀浆亚油酸含量，使脂类代谢恢复正常从抑制炎症的进程；通过增加二十二碳六烯酸（DHA）的释放，使炎症反应产生时AA释放量减少，抑制炎性介质的产生。 （4）尿液中筛选出27差异代谢物，这些差异代谢物与谷氨酸盐和谷氨酸酯代谢，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，半乳糖代谢，花生四烯酸代谢、丙酮酸代谢，戊醣酸途径，柠檬酸循环，氨酰基-tRNA生物合成及糖酵解和糖质新生通路有重要的相关性，提示当归挥发油抗炎作用可能是通过降低尿液中谷氨酸、琥珀酸、丙酮酸含量使三羧酸循环障碍恢复，回调葡萄糖、半乳糖等含量使糖酵解、戊醣酸途径代谢恢复正常，增加丝氨酸、甘氨酸的合成、减少谷氨酸的积累，提高机体的抗氧化能力以发挥抗炎作用。 4、采用MetPA数据库构建各组血浆、肝组织匀浆、肺组织匀浆、尿液筛选出的所有差异代谢物的相关代谢通路，其中谷氨酸盐和谷氨酸酯代谢，亚油酸代谢，亚麻酸代谢，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，丙氨酸、天冬氨酸盐和谷氨酸盐代谢，甘油酯代谢，半乳糖代谢，缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的生物合成，花生四烯酸代谢，戊糖和葡萄糖醛酸酯互换现象，丙酮酸代谢，戊醣酸途径，氨基糖和核苷酸糖代谢，半胱氨酸和蛋氨酸代谢，氨酰基-tRNA生物合成，糖酵解和糖质新生，柠檬酸循环影响值大于0.1，认为这些代谢通路是与LPS致炎、OVASL、OVASM、OVASH、Dex干预作用有密切的相关性。采用Matlab软件对所有差异代谢物及其KB、LPS炎症模型组、OVASL、OVASM、OVASH进行热点聚类分析，所筛选的差异代谢可以表征KB、LPS炎症模型、Dex、OVASM、OVASL、OVASH各组。当归挥发油和地塞米松能回调变化的代谢物，当归挥发油回调的代谢物与地塞米松回调的代谢物有部分重叠，但也存在差异。大鼠LPS所致炎症模型造成代谢紊乱的中心环节可能是三羧酸循环发生障碍、糖酵解促进及脂肪酸代谢紊乱，使相关谷氨酸及谷氨酸酯代谢、支链氨基酸代谢等紊乱，当归挥发油可以促使三羧酸循环、糖酵解及脂肪酸代谢紊乱恢复，从而达到抗炎作用。 5.采用Spss软件对所检测到的差异代谢物与检测的炎性因子、炎性介质指标进行相关性分析，表明所筛选琥珀酸、丙酮酸、葡萄糖、乳酸、乙酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸具有生物学意义。 综上，当归挥发油通过其多成分（Z-藁本内酯、甲酸、1S--蒎烯、6-十一烷酮、罗汉柏烯、-雪松烯、2-甲氧基苯酚、(+)-香橙烯、-(甜)没药烯、(-)-匙叶桉油烯醇、Z-丁烯基酞内酯、E-藳本内酯）作用于多个代谢通路（谷氨酸盐和谷氨酸酯代谢，亚油酸代谢，亚麻酸代谢，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，甘油酯代谢，半乳糖代谢，缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的生物合成，花生四烯酸代谢，戊糖和葡萄糖醛酸酯互换现象，丙酮酸代谢，戊醣酸途径，糖酵解和糖质新生，三羧酸循环）使LPS炎症所造成的三羧酸循环、糖酵解及脂肪酸代谢等紊乱恢复。所筛选的琥珀酸、丙酮酸、葡萄糖、乳酸、乙酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸等差异代谢物具有生物学意义，可以作为LPS致炎及当归挥发油抗炎的生物标志物。