牡丹组培离体再生系统的建立

本文以牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)单瓣品种‘凤丹白’为主要试材,初步建立了牡丹组培离体再生系统。 实验测定了不同花型品种叶片间及‘凤丹白’5种不同类型外植体(幼叶、成龄叶、幼茎、暗处理叶片、子叶)间总酚含量和PPO活性,分析了总酚含量、PPO活性与外植体褐化的关系;通过不同的消毒、预处理、培养基类型和培养条件的选择,对牡丹幼叶初始培养的褐变进行了研究;以幼叶、未木质化叶柄、子叶为外植体,研究了培养基类型、激素种类及浓度配比、碳源、培养条件等因素对牡丹组培离体再生系统建立的影响;研究了不同培养基组分对成熟胚直接诱导丛生芽“玻璃化”程度的影响;以休眠侧芽为外植体比较了60个牡丹品种的扩繁能力。 研究结果如下: (1) 确定了牡丹初始培养的较佳外植体类型。不同品种间或同一品种的不同类型外植体间,总酚含量、PPO活性、初始外植体褐化率差异显著。子叶和幼茎的总酚含量、PPO活性较其它类型外植体低,是初始培养最佳的外植体。 (2) 筛选了有效降低外植体褐变的技术措施。外植体经过浓度为10%的次氯酸钠(有效氯1%)消毒10min后,用无菌的抗氧化剂预处理液(MS+150mg/L柠檬酸+100mg/L抗坏血酸,pH4.5)对外植体进行30min预处理,以WPM作为基本培养基,辅加500mg/L PVP或15mg/L Vc,在弱光、较低的温度(18～20℃)培养,可有效减轻外植体的褐变。 (3) 筛选出牡丹离体培养的培养基类型。诱导愈伤组织的最佳培养基为WPM培养基,添加2,4-D 0.5mg/L+TDZ 0.5mg/L或2,4-D 1mg/L+TDZ 1mg/L的激素组合。利用来源于子叶的愈伤组织进行不定芽分化的培养基为WPM+0.5mg/L TDZ。以成熟胚为外植体直接诱导丛生芽的最佳培养基为WPM+6-BA2.5mg/L+2,4-D 0.1mg/L。生根最佳培养基为1/2 WPM+2mg/L IBA。在低温、暗培养条件下处理10天,在生根前进行5周壮苗处理,有利于提高无根苗的生根率。移苗前打开瓶盖炼苗3～5天,培养室内保持温度严格控制在25℃±1℃,湿度大于80%,可使幼苗移栽成活率达到80%以上。 (4) 解决了牡丹丛生芽诱导后的“玻璃化”现象。在WPM培养基中添加NAA0.1mg/L+6-BA1mg/L,选用7g/L琼脂可有效改善丛生芽的“玻璃化”现象。 (5) 牡丹基因型的差异是影响离体扩繁的主要原因。以休眠侧芽为外植体,通过对60个牡丹品种间的扩繁能力比较,发现扩繁能力的大小取决于基因型。不同品种间扩繁能力差异显著,不同品种间繁殖系数介于2～5之间。总的来看,在连续继代培养48周后(约1年),扩增率下降,只有‘大胡红’、‘紫金绫’、‘丛中笑’保持较高扩增率。