土鳖虫含药血清对激素诱导骨髓间充质干细胞成脂和成骨分化差异蛋白组学的影响

目的： 探讨土鳖虫干预骨髓间充质干细胞(BMSCs)成脂和成骨分化的分子生物学机制,检验抑制成脂分化和促进成骨分化的靶位蛋白或相关蛋白,为中药土鳖虫治疗激素所致的股骨头缺血性坏死提供理论依据。 方法： 1.选用优质中药土鳖虫,采用十天法制备土鳖虫含药血清。 2.取4周龄清洁级SD大鼠胫骨和股骨骨髓进行BMSCs贴壁培养和传代,检测传三代BMSCs表面抗原CD45、CD90的表达阳性率以鉴定,用油红“O”染色对分化的脂肪细胞进行鉴定。 3.传三代BMSCs分为空白对照组、激素组和土鳖虫组。激素组：应用大剂量激素诱导使其向脂肪细胞分化,土鳖虫组：激素诱导的同时给予土鳖虫含药血清干预。 4.各组干预6天后对成骨和成脂标志物碱性磷酸酶(ALP)、甘油三酯(TG)检测。 5.利用光镜和电镜观察三组BMSCs细胞的细微和超微结构特点。 6.运用同位素标记相对和绝对定量技术(iTHAQ)标记三组样本的蛋白,二维液相色谱质谱仪(2D LC-MS/MS)鉴定蛋白并进行相对定量分析。 结果： 1.根据表面抗原CD45和CD90的阳性率,鉴定培养的细胞是BMSCs;根据油红“O”染色,鉴定激素诱导BMSCs成脂肪细胞。 2.甘油三酯检测结果：激素组较空白对照组明显升高(P<0.05),土鳖虫组较激素组明显下降(P<0.01)。 3.碱性磷酸酶检测结果：激素组较空白对照组明显下降(P<0.05),土鳖虫组较激素组明显升高, (P<0.01)。 4.透射电镜观察超微结构结果：空白对照组大鼠BMSCs细胞表面有较丰富的微绒毛样突起。细胞质可见较多细胞器,可见少量脂肪滴。激素组的BMSCs细胞表面无微绒毛样突起。细胞内可见大量脂肪滴,少量细胞器。部分细胞核溶解,破裂。土鳖虫组的BMSCs细胞表面有少量的微绒毛样突起。细胞器数量一般,未见脂肪滴。 5.通过质谱鉴定共成功检测出了三组样本近520种蛋白质,其中217种蛋白质有定量信息。以激素组为对照,在空白对照组中共有15种蛋白质出现显著的表达上调,12种出现下调蛋白；在土鳖虫组中共有16种蛋白质出现显著的表达上调,14种出现显著下调。 结论： 1.土鳖虫含药血清可以抑制BMSCs成脂分化,促使BMSCs成骨分化。 2.通过质谱鉴定三组共成功检测出了520种蛋白质,其中217种蛋白质有定量信息。 3. Hspa1L和PrxⅤ两个蛋白可能是土鳖虫抗细胞凋亡的作用靶点。 4. Serpinh1和ADP/ATP translocase 1表达可能是土鳖虫促进成骨分化的作用靶点。