印楝油抗生育活性物质的分离纯化、结构鉴定及作用机理研究

有效控制鼠害是保障农牧业可持续发展的关键环节之一。我国现有灭鼠剂主要是增加鼠的死亡率，但均无持效性，且灭鼠后的低密度时间最长仅维持一年左右，此后鼠密度逐渐上升而恢复至原有水平，且传统灭鼠剂还存在对环境和其它生物有毒副作用和成本高等弊端。因此，鉴于传统灭鼠剂存在的这些不足，本研究试图探索出一种新的灭鼠策略：即从保持生态平衡的角度出发，寻求一种控制鼠类出生率的植物性不育剂，通过降低鼠类群体的繁殖率而实现降低群体密度，从而达到从根本上消除鼠害的目的，且对人类和其他动物、环境安全无害，效果持久。 印楝油(Neem oil)是印楝(Azadirachta indica A．Juss)种子的提取物，未稀释的印楝纯油有很强的杀精子作用，经对罗猴和人体实验，避孕效果达100％。为了研制新型的不育剂和开发利用印楝，本研究对印楝油抗生育活性物质进行了提取和分离纯化，并对其进行了结构鉴定；经过口服试验研究了活性物质的抗生育作用机理和对哺乳动物的安全性；为增加其适口性和检测其应用效果，对活性物质进行了微胶囊包埋和室内动物试验。其研究结果有利于从各种水平上解释活性物质的抗生育机理，有利于将印楝油研制为有发展前景的“生物合理性”不育剂，为我国控制草原鼠害和环境保护事业做出贡献。主要研究结果如下： 四川大学博士学位论文 1.首次从印株油中成功分离出抗生育活性物质单体，并进行了结构鉴定。 本研究了利用生物活性跟踪法，经过分级萃取、分段柱层析与薄层层析相结合， 再经重结晶等过程得到具有较高杀精作用的活性物质一印株油A。印糠油A的获 取率为0.31%，生物活性试验结果表明其对小鼠精子的体外瞬间杀精浓度为 Zmg/ml/205，杀精活性物质主要位于中间极性萃取物(氯仿提取物)中;经IR、 E卜MS、NMR解析印株油A的结构，鉴定印糠油A为2一十八酸一4一十六酸一2，4一二 戊酷(2一oetadeeanoie aeid，4一Palmitie aeid，2，4一Pentanediyl ester)，该 物质为首次在印株油中发现，有望成为一种新型杀精剂。 2.首次较全面地从细胞水平、亚细胞水平、分子水平和激素水平研究了印 棣油氯仿提取物的抗生育作用。昆明种雄性小鼠口服印株油氛仿提取物 29/kg.d，每天1次，连续1周，停药后第3周取材。结果表明:试验小鼠口服 印棣油氯仿提取物后，在停药后1一6个月避孕率为100%，7一12个月后慢慢恢复， 表明该抗生育剂可保持较长时期的可逆行不育。血液中各种酶、电解质等生化 指标的变化趋势基本一致，即先降低，然后慢慢恢复致正常水平，表明其无毒 副作用;血清辜酮含量在服药前后无明显改变，表明其不影响试验小鼠的性行 为。对生殖器官的影响表现为:辜丸组织氨基酸代谢受阻，攀丸曲细精管直径 明显缩小，精原细胞、精母细胞及精子细胞数量减少，吞噬细胞增多;超微结 构显示精子头部顶体与核膜被破坏，在核质膜周边形成大小不一的虫蚀状缺痕， 严重者，细胞核膜破裂、缺损，核染色质不均匀，呈颗粒样改变，有空泡形成， 甚至溶解，精子细胞质内线粒体髓样变性，脊断裂和溶解，有的脊间隙扩大呈 空泡状或管状，表明其抗生育作用机制主要是杀精子作用和破坏生精过程;流 式细胞术研究结果表明印棣油氯仿提取物引起辜丸组织生精细胞减少，细胞凋 亡率升高，结合曲细精管内吞噬细胞增多的变化，提示其抗生育作用机理可能 与细胞免疫介导有关。血清中血清蛋白升高，而Q一球蛋白、p一球蛋白和Y 一球蛋白含量下降，这种变化是药物阻断生殖过程在生理学方面的反映。 3.印糠油氯仿提取物安全，属无毒化合物。该提取物对大鼠、家兔的安全 性试验结果表明:印株油氯仿提取物对大鼠的急性经口LDso>1 o000mg/kg，对大 鼠的急性经皮LD50>S000mg/kg，对家兔皮肤，眼粘膜无刺激性，属无毒化合物， 有望作为高效、安全、无公害不育剂在生产中应用。 4.为增加印株油鼠类不育剂的适口性，以从印株油氯仿提取物中分离纯化 四川大学博士学位论文 出的2一十八酸一4一十六酸一2，4一二戊酷为主体药物，采用复凝聚法，将其制成微 胶囊，考察了微胶囊的形态特征、包封率和载体回收率;同时将制备的微胶囊 制剂作为毒饵，以0.5%的比例加入到饲料中，同时设不加毒饵对照组，试验雄 鼠在密闭的室内自由采食，考察了其适口性和抗生育作用。结果表明，微胶囊 平均粒径为100一180 pm，且该制剂能实现对药物的有效负载，包封率和载体回 收率达到90%以上。该微胶囊制剂适口性良好，小鼠对之不产生拒食性;抗生育 试验结果表明，小鼠口服该制剂后，前6个月，避孕率达100%，7一12个月后雌 鼠怀孕率逐渐回升，怀孕率为38一50%，组织学变化表现为曲细精管直径明显缩 小，精原细胞、精母细胞及精子细胞数量均明显减少，说明不育效果不受微胶 囊化的影响。 关键词:印糠油抗生育活性物质;分离纯化;结构鉴定;抗生育作用机理; 安全性试验;微胶囊;室内试验