灵芝子实体多糖的分离分析及其免疫活性与色谱指纹图谱的相关性研究

灵芝是中医药学宝库中的珍品，有“功能食品资源”之美誉。由于其具有显著的免疫调节等多种生理功效，其研究和开发一直备受关注。近年来，灵芝产品产业迅速发展，但灵芝质量良莠不齐，难以有效控制和鉴别，这主要是因为灵芝子实体、孢子粉、菌丝体以及他们的加工产品组成十分复杂，而检测方法尚薄弱，未形成有效的灵芝类产品的生产质控体系和市场质量监管体系。灵芝多糖是灵芝的主要活性成分，《中国药典》也以灵芝多糖含量的高低来评价灵芝质量的好坏。 本课题为建立有效的灵芝子实体及其多糖产品的质量检测方法，拟研究高效体积排阻色谱（HPSEC）和部分酸水解耦合PMP柱前衍生化反相高效液相色谱（RP-HPLC）两种色谱指纹图谱与其免疫活性的谱效关系。同时，通过对不同灵芝多糖级分的分离纯化、组成和结构分析以及上述HPSEC、RP-HPLC检测图谱中免疫活性相关峰的归属分析，为探索研究灵芝多糖的功效关系和后续进一步优化灵芝多糖的部分水解条件及其功效指纹图谱研究方法提供科学依据。 以灵芝子实体为实验材料，通过水浴回流提取，树脂脱色及Sevag法去蛋白后，用DEAE Sepahrose Fast Flow离子交换柱层析对灵芝子实体多糖进行分离纯化，最终得到5种灵芝多糖级分，分别为GLPJD1、GLPJD2、GLPLD1、GLPLD2、GLPLD3。本实验首先以0.1N NaNO3为流动相比较了Shodex OHpak SB-803、SB-804、SB-805HQ8.0mmID300mmL三根柱串联；Ultrahydrogel250、Ultrahydrogel2000两根柱串联；Ultrahydrogel Linear7.8300mm column两根柱串联这三个柱系统对两种不同灵芝粗多糖进行HPSEC分析的分离效果。同时也比较了0.1N NaNO3和0.1N NaAc两种不同流动相条件下，柱分离效果。HPSEC分析结果表明：Shodex OHpak SB-803、SB-804、SB-805HQ8.0mmID300mmL三根柱串联分离效果较好，且0.1N NaNO3和0.1NNaAc两种流动相对分离效果影响差异不明显，因此本文后续的HPSEC分析均采用Shodex OHpak SB-803、SB-804、SB-805HQ8.0mmID300mmL三根柱串联，0.1NNaNO3为流动相。 通过高效体积排阻色谱分析表明，5种多糖均基本为单一对称的峰，因此推测五种多糖纯度较高，且它们的重均相对分子质量分别为4.41106、4.70106、7.86103、7.38103、1.77104Da。红外光谱分析结果则表明灵芝子实体多糖异头碳均为β型，1750cm-1处特征吸收峰显示灵芝子实体多糖级分均具有糖醛酸。另外，对五种灵芝子实体多糖级分完全酸水解后进行单糖组成测定，结果发现，五种多糖级分确实含有少量的糖醛酸，且多糖组成有较大的差别。SEC-LLS分析结果显示GLPJD1、GLPJD2、GLPLD1、GLPLD2、GLPLD3的绝对分子量分别为12.18106、7.086106、0.012106、0.017106、0.019106Da，且纯度均较高。 为了更好的表征灵芝多糖的谱效关系，本文选择了检测灵芝多糖体外促进正常小鼠巨噬细胞的增殖活性，分析结果表明不同来源、不同培养方式的灵芝子实体多糖的促进巨噬细胞增殖活性不同。其中7与13号灵芝子实体多糖均为来自浙江的韩芝子实体的不同来源的品种，14号为来源于江西的赤芝子实体品种，9号为来自辽宁的的赤芝子实体品种，它们的促进正常小鼠巨噬细胞增殖的活性均较好，而且GLPJD1与GLPJD2多糖级分较GLPLD1、GLPLD2、GLPLD3的多糖级分的活性要高。 本文通过对29个不同来源的灵芝子实体中多糖的HPSEC和PMP反相HPLC的指纹图谱分析以及这些多糖样品的促进正常小鼠巨噬细胞增殖活性试验，初步探索构建了这两种指纹图谱与灵芝多糖免疫活性的谱效关系。HPSEC的谱效相关性分析结果显示，Mw<5000Da的多糖级分基本没有促进正常小鼠巨噬细胞增殖活性，而Mw＞1106Da及Mw在1105～5105Da区间的HPSEC峰段与促进正常小鼠巨噬细胞增殖活性呈正相关，并且对免疫活性影响较大。PMP-RP HPLC的谱效相关性分析结果表明，其正相关峰主要来自特征峰19及半乳糖醛酸峰。这两个正相关峰和Mw＞1106Da及分子量1105～5105Da的HPSEC峰段的相对量的高低可以作为判断灵芝子实体及其多糖产品的质量优劣和活性高低的主要指标的一部分，以供后续进一步的研究论证参考。