目的:观察硝菔通结方对功能性便秘大鼠醛固酮(ALD)合成和分泌以及水通道蛋白的影响,从现代医学肾脏调节水液代谢的角度揭示硝菔通结方从肾论治便秘的作用机制。方法:1.选用健康SPF级SD大鼠60只,采用随机法分为空白组(10只)和造模组(50只),制备复方地芬诺酯混悬液,造模组灌胃复方地芬诺酯混悬液6周复制便秘模型,取结肠组织进行HE染色,光镜下观察结肠组织病理形态,判断模型是否成功;2.确定造模成功后,正常组及模型组给予同体积的生理盐水灌胃,各治疗组给予不同剂量的硝菔通结方、阳性药物对照组给予苁蓉通便口服液(后简称口服液组)灌胃一月左右结束。观察各组大鼠的一般情况以及结肠含水率,处死各组大鼠,取腹主动脉血离心取上清后用ELISA法检测醛固酮(ALD)、肾素(PRA)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、血管紧张素转化酶(ACE)、抗利尿激素(AVP)以及环磷酸腺苷(c AMP)的含量;免疫荧光法检测肾脏MR蛋白以及肾脏和结肠AQP1、AQP2、AQP3蛋白的表达;RT-PCR法检测肾脏MRm RNA以及肾脏和结肠中AQP1、AQP2、AQP3的表达水平;Western-blot法检测肾脏和结肠中AQP1、AQP2、AQP3蛋白的表达。3.实验数据采用SPSS 17.0软件进行分析,组间比较,采用单因素方差分析,当p<0.05时,差异有统计学意义。结果:1.硝菔通结方对功能性便秘模型大鼠一般生理情况以及粪便含水率的改善:硝菔通结方(高、中、低剂量)组和口服液组灌胃1月后,大鼠外观、兴奋度、大便等基本恢复正常,其中高剂量组和口服液组的疗效较为明显;与空白组相比,模型组大鼠粪便量以及含水率明显减少(P<0.01),与模型组相比,硝菔通结方高剂量组及口服液组大鼠粪便量以及含水率显著增多(P<0.01),中剂量组大鼠结肠含水量增多(P<0.05),小剂量组无明显差异(P>0.05)。2.硝菔通结方对功能性便秘模型大鼠ALD分泌与合成的影响:(1)与空白组比较,模型组大鼠血清中的ALD和AngⅡ、ACE含量升高(P<0.05),血清中的PRA含量显著高于空白组(P<0.01);模型组大鼠肾脏组织中MR的表达增强,MRm RNA表达升高(P<0.05);与模型组比较,硝菔通结方高剂量组与口服液组大鼠血清中ALD、AngⅡ含量明显降低(P<0.05),大鼠血清中PRA的含量显著降低(P<0.01),中剂量组与低剂量组无明显差异(P>0.05);(2)与空白组比较,模型对照组大鼠MR蛋白在肾脏集合管主细胞胞膜和胞浆强表达,荧光着色强。与模型对照组比较,各治疗组大鼠MR蛋白在肾脏集合管主细胞胞膜和胞浆表达减少,呈现弱阳性,荧光着色减少,颜色渐弱,恢复或接近空白对照组大鼠水平;(3)与空白组比较,模型组大鼠肾脏MRm RNA表达升高(P<0.05);与模型组比较,硝菔通结方各剂量组与口服液组大鼠肾脏MRm RNA表达降低(P<0.05)。3.硝菔通结方对功能性便秘模型大鼠水通道蛋白的影响:(1)对血清中AVP以及cAMP含量的影响与空白组比较,模型组大鼠血清中的AVP以及c AMP含量均高于空白组(P<0.05);与模型组比较,硝菔通结方各剂量组与口服液组大鼠血清中AVP以及c AMP含量均降低(P<0.05);(2)对肾脏、结肠组织中AQP3蛋白表达的影响(免疫荧光法)与空白组比较,模型组肾脏AQP1在肾单位的近端小管、AQP2和AQP3在集合管细胞上皮细胞胞膜和胞浆强表达,荧光着色强;结肠AQP1、AQP2和AQP3在结肠上皮细胞胞膜和胞浆强表达,荧光着色强。经硝菔通结方治疗后,与模型组比较,硝菔通结方高剂量组与口服液组AQP1、AQP2和AQP3在肾脏和结肠细胞胞膜和胞浆表达减少,呈现弱阳性,荧光着色减少,颜色渐弱,整体荧光度弱;中剂量组大鼠AQP1、AQP2和AQP3在肾脏和结肠胞膜和胞浆内中度阳性表达;低剂量组大鼠AQP1、AQP2和AQP3在肾脏和结肠细胞胞膜和胞浆内呈现阳性表达。(3)对肾脏、结肠组织中AQP1m RNA、AQP2m RNA以及AQP3m RNA表达的影响与空白组比较,模型组AQP1m RNA、AQP2m RNA、AQP3m RNA的水平显著升高(P<0.01),与模型组相比较,硝菔通结方各剂量组与口服液组的AQP1m RNA、AQP2m RNA、AQP3m RNA表达水平显著降低(P<0.01)。(4)对肾脏、结肠组织中AQP1、AQP2以及AQP3表达水平的影响与空白组比较,肾脏与结肠AQP1、AQP2以及AQP3的表达水平显著升高(P<0.01),与模型组比较,肾脏与结肠AQP1、AQP2以及AQP3的表达水平显著降低(P<0.01)。结论:1.硝菔通结方能明显改善功能性便秘大鼠的便秘症状,增加粪便量以及粪便含水率,改善肠道水液代谢。2.硝菔通结方可降低模型大鼠血清中ALD、PRA、AVP、c AMP的含量,还可下调大鼠肾脏MR蛋白的表达和MRm RNA水平,以及肾脏和结肠组织中AQP1、AQP2、AQP3m RNA以及AQP1、AQP2、AQP3的表达量,同时增加粪便组织的含水率。说明硝菔通结方能通过降低肾脏对水液的重吸收,纠正便秘大鼠肠道水液代谢紊乱而对功能性便秘发挥治疗作用,其机制可能与通过影响ALD的合成和分泌,以及调节肾脏水通道蛋白有关;3.肾脏能通过调节ALD和水通道蛋白而降低对水液的重吸收,纠正便秘大鼠肠道水液代谢紊乱而对功能性便秘发挥治疗作用,这可能是中医“从肾论治便秘”的科学内涵之一。
