五种天然有效部位生物总碱的提取分离及体外抗肿瘤作用研究

恶性肿瘤严重威胁着人类生命和健康。手术、化疗和放疗是肿瘤治疗的三大手段,其中化疗在肿瘤多学科、多手段的综合治疗中发挥着举足轻重的作用。然而肿瘤化疗在一定程度上仍有其局限性,如对肿瘤细胞的特异性抑制作用不强,毒副反应较大等。中医药作为我国的传统医学,在恶性肿瘤综合治疗中有着独特的优势。大量临床实践表明,中医药在提高恶性肿瘤的临床疗效、改善生活质量方面,发挥着越来越重要的作用。中药大多来源于植物,随着回归自然热潮的兴起,从中药(传统植物药)中挖掘和开发具有高效、低毒、廉价、广谱的天然抗肿瘤药物成为研究的热点。研究发现中药所含的多种成分均有不同程度的抗肿瘤作用,如生物碱类(长春碱、喜树碱)、二萜类化合物(紫杉醇、冬凌草甲素)。已经证实中药黄连、吴茱萸、苦参等具有较显著的抗肿瘤作用,其生物碱类成分为其主要成分。随着现代药物提取分离纯化手段的不断升级,从传统中药中寻找抗肿瘤作用的有效成分和有效部位,并在此基础上研制抗肿瘤新药具有巨大的潜力和发展前景。 [目的] 1.比较三种不同提取工艺：水提、醇提、酸提方法对吴茱萸、黄连、苦参、延胡索、钩藤有效部位—生物总碱的分离提取；得出相应最佳提取工艺。 2.利用HPLC对五种天然有效部位—生物总碱中所含有效成分进行含量测定。 [方法] 1.分别采用水提法、醇提法、酸提法三种不同提取工艺提取吴茱萸、黄连、苦参、延胡索、钩藤,制备得到相应有效部位—生物总碱；比较得出相应最佳提取工艺。 2.利用高效液相色谱仪HPLC对生物总碱中所含相应有效成分进行含量测定。 [结果] 1.三种提取工艺分离、提取五种天然抗肿瘤有效部位—生物总碱含量的比较：醇提法>酸提法>水提法 2.HPLC检测五种天然有效部位—生物总碱中相应有效成分含量的比较： ①延胡索总碱(延胡索乙素/总碱)：醇提>酸提>水提 ②黄连总碱(盐酸小檗碱/总碱)：醇提>酸提>水提 ③吴茱萸总碱(吴茱萸次碱/总碱)：酸提>水提>醇提 ④苦参总碱：醇提>酸提>水提氧化苦参碱/总碱：醇提>酸提>水提苦参碱／总碱：水提>酸提>醇提 ⑤钩藤总碱：未能精确测定其所含钩藤碱、异钩藤碱的含量 [目的] 考察水提法、醇提法、酸提法提取分离得到的吴茱萸、黄连、苦参、延胡索、钩藤五种生物总碱对人源胃癌细胞株的体外增殖抑制作用,比较得出抑制率最强的生物总碱。考察有效部位生物总碱与相应有效成分对人源胃癌细胞株抗肿瘤活性的比较。 [方法] 1.生物总碱的制备：采用水提、70%乙醇提取、1%醋酸提取法分别制备吴茱萸、黄连、苦参、钩藤、延胡索有效部位—生物总碱。 2.细胞增殖抑制实验：运用MTT法考察五种天然有效部位及相应有效成分对人源胃癌细胞株BGC-823、MKN-45的体外抗肿瘤作用。生存率=实验组OD/对照组OD×100%,抑制率=(1-实验组OD/对照组OD)×100%。 3.形态学观察：用不同浓度的吴茱萸总碱、黄连总碱、苦参总碱、钩藤总碱、延胡索总碱处理人胃癌细胞株BGC-823和MKN-45后,在倒置显微镜下观察用药组细胞形态学变化,并拍照。 [结果] 1.吴茱萸总碱、黄连总碱、苦参总碱、延胡索总碱、钩藤总碱对人源胃癌细胞MKN-45、BGC-823均有增殖抑制作用,且随着药物浓度的增加,抑制率逐渐增强,呈剂量-效应依赖关系。 2.五种生物总碱在2μg/ml-200μg/ml之间对人胃癌细胞株MKN-45抑制率比较：水提吴茱萸总碱>水提黄连总碱>醇提钩藤总碱>醇提苦参总碱>醇提延胡索总碱 ①吴茱萸总碱：水提吴茱萸总碱>醇提吴茱萸总碱>酸提吴茱萸总碱 ②黄连总碱：水提黄连总碱>醇提黄连总碱>酸提黄连总碱 ③苦参总碱：醇提苦参总碱>水提苦参总碱>酸提苦参总碱 ④延胡索总碱：醇提延胡索总碱>水提延胡索总碱>酸提延胡索总碱 ⑤钩藤总碱：醇提钩藤总碱>水提钩藤总碱>酸提苦参总碱 3.有效部位生物总碱与有效成分在2μg/ml-200μg/ml之间对人胃癌细胞株MKN-45抑制率比较：水提吴茱萸总碱>吴茱萸次碱；水提黄连总碱>盐酸小檗碱醇提延胡索总碱<延胡索乙素；氧化苦参碱>醇提苦参总碱>苦参碱 4.五种生物总碱在6.25μg/ml-200μg/ml之间对人胃癌细胞株BGC-823作用48小时后,随着药物浓度的增加,抑制率逐渐增强,呈剂量-效应依赖关系。 5.水提吴茱萸总碱、水提黄连总碱、醇提苦参总碱、醇提延胡索总碱、醇提钩藤总碱在作用于胃癌BGC-823细胞48小时时,细胞生长受到明显抑制,水提黄连总碱抗肿瘤作用显著,其IC50 20.34μg/ml,不同药物浓度组间具有显著差异性。 6.细胞形态学变化：正常情况下,人胃癌细胞株BGC-823和MKN-45呈多角形,梭形,贴壁生长。在五种生物总碱的作用下,癌细胞逐渐变圆,皱缩,贴壁细胞数减少,细胞肿胀,大小不一致,细胞间隙增宽,随着药物浓度的增加,出现大量细胞碎片。 [结论] 1.吴茱萸总碱、黄连总碱、苦参总碱、钩藤总碱、延胡索总碱对人胃癌细胞株BGC-823、MKN-45体外具有较显著的增殖抑制的作用,在一定剂量范围内,呈剂量-时间依赖关系,其中水提吴茱萸总碱和水提黄连总碱对胃癌细胞株的抗肿瘤作用显著。 2.水提吴茱萸总碱、水提黄连总碱、醇提苦参总碱、醇提延胡索总碱、醇提钩藤总碱对人胃癌细胞BGC-823半数抑制的IC50分别为：25.76μg/ml、20.34μg/ml、68.51μg/ml、34.50μg/ml、33.10μg/ml。 3.水提吴茱萸总碱、水提黄连总碱较相应有效成分对人胃癌细胞增殖抑制作用强。