东北梅花鹿鹿茸cDNA文库的构建及初步鉴定

本试验为克隆出与鹿茸生长发育相关基因的全长序列,采用SMART技术构建了东北梅花鹿鹿茸尖端组织的全长cDNA文库。采取人工驯养的健康4岁东北梅花鹿为试验动物,取其生茸期鹿茸尖端组织为实验材料,利用SV Total RNA抽提试剂盒分离提取和纯化总RNA；反转录成单链cDNA, LD-PCR方法合成双链cDNA; PCR产物经蛋白酶K水解、纯化后,用Sfil酶切；将酶切产物通过CHROMA SPIN-400TM柱进行分级分离,回收片段长度在500bp以上的cDNA组分,与pDNR-LIB质粒载体连接,电转化入E.coli.DH5a高效感受态细胞中,建成原始文库；鉴定文库的滴度和重组效率后,进行文库扩增；随机挑取单菌落噬菌斑,用载体克隆位点两端的通用引物进行PCR扩增,以检测所构建的cDNA文库的质量。试验结果表明：总RNA电泳中18S、28S两条带清晰明显无降解,总RNA质量好、纯度高,符合建库要求。经鉴定,文库得到约2.56x106个重组子,重组效率接近100%,插入片段长度在0.5-2.0kb之间,平均长度为1.1kb。本试验文库各项指标均达到了标准cDNA文库的要求,可用于全长cDNA的筛选,成功的构建了东北梅花鹿鹿茸cDNA文库。 东北梅花鹿鹿茸生长中心组织cDNA文库的成功构建,不仅保存了珍贵的梅花鹿基因资源,也为以后EST测序分析,基因表达谱构建,分析功能基因在鹿茸组织生长发育不同时期的表达奠定了前期基础。