目的:丹蛭降糖胶囊(DJC)是安徽中医药大学第一附属医院内分泌科的临床经验方,本课题在前期实验研究的基础上,通过建立2型糖尿病血管病变大鼠模型,对丹蛭降糖胶囊主要药效学指标进行考察;同时,运用UPLC/QTOF-MS现代技术来研究丹蛭降糖胶囊干预4周后,大鼠尿液、血清代谢图谱的变化,获得相应代谢谱并对其进行模式识别和解析,鉴定可能的潜在生物标志物,研究丹蛭降糖胶囊防治糖尿病血管病变的物质基础以及作用机制,为创新中药复方制剂的研究方法进行积极探索。方法:1、雄性SD大鼠,高脂饲料喂养4周,按35mg/kg剂量,腹腔注射链脲佐菌素(STZ)(0.1mmo L/L柠檬酸缓冲液溶解,p H=4.2)。3天后,以随机血糖≥16.7mmo L/L为标准,筛选2型糖尿病血管病变模型大鼠。造模成功后,灌胃给药丹蛭降糖胶囊,连续给药4周,每周尾静脉取血检测血糖。给药2周时,各组随机选择大鼠6只,腹腔注射3.5%水合氯醛麻醉,腹主动脉取血5.0m L于肝素抗凝管中。给药4周后,大鼠禁食12h,处死,麻醉腹主动脉取血。动态观察给药2周和4周时的指标物质的含量变化。采集得到的血液,静置2h后,离心取血浆。用双抗体夹心法测定血浆中NO、ET-1、PAI、t-PA、TXB2和6-keto-PGF1α。取大鼠胸主动脉,HE染色观察血管内皮细胞形态。2、建立基于UPLC/QTOF-MS技术的尿液代谢组学平台,运用该技术对高脂饲料结合小剂量STZ诱导的2型糖尿病血管病变大鼠模型进行尿液代谢组学,观察丹蛭降糖胶囊干预4周后,丹蛭降糖胶囊对模型大鼠尿液代谢谱影响,结合主成分分析(Principal Components Analysis,PCA)和偏最小二乘法(Partial Least Squares Diseriminant analysis,PLS-DA)比较正常组、模型组和丹蛭降糖胶囊组之间尿液中内源性代谢物的差异。根据VIP值和P值确定与丹蛭降糖胶囊防治2型糖尿病血管病变相关的生物标志物,并结合Human Metabolome Database和Kegg Compound Database数据库中,对各生物标志物可能的代谢通路进行分析。3、建立基于UPLC/QTOF-MS技术的血清代谢组学平台,运用该技术对高脂饲料结合小剂量STZ诱导的2型糖尿病血管病变大鼠模型进行血清代谢组学,观察丹蛭降糖胶囊干预4周后,丹蛭降糖胶囊对模型大鼠血清代谢谱影响,结合主成分分析(Principal Components Analysis,PCA)和偏最小二乘法(Partial Least Squares Diseriminant analysis,PLS-DA)比较正常组、模型组和丹蛭降糖胶囊组之间血清中内源性代谢物的差异。根据VIP值和P值确定与丹蛭降糖胶囊防治2型糖尿病血管病变相关的生物标志物,并结合Human Metabolome Database和Kegg Compound Database数据库中,对各生物标志物可能的代谢通路进行分析。结果:1、与正常大鼠相比,模型组大鼠血糖明显升高(P<0.01);与模型组相比,给药2周后,各给药组的血糖均有所下降,其中二甲双胍组(P<0.01)参芪降糖组(P<0.05)具有统计学意义;给药3周后与模型组相比,丹蛭降糖胶囊高剂量组血糖显著降低(P<0.05),阳性对照药组下降趋势更加明显(P<0.01);给药4周后各给药组血糖较模型组均显著下降(P<0.01)。和正常组大鼠相比,模型组大鼠血浆NO、t-PA和6-keto-PGF1α水平显著降低(P<0.01),血浆ET-1、PAI和TXB2水平显著升高(P<0.01)。给药2周,和模型组相比,给药组大鼠血浆中NO、t-PA和6-keto-PGF1α含量升高,血浆ET-1、PAI和TXB2水平降低。给药4周后,和模型组相比,丹蛭降糖胶囊组可以升高血浆NO、t-PA和6-keto-PGF1α水平(P<0.01或P<0.05),降低血浆ET-1、PAI和TXB2(P<0.01或P<0.05)。HE染色切片显示,正常大鼠胸主动脉内膜光滑,内皮细胞完整,中膜层平滑肌细胞排列整齐,无局部缺损以及组织增生现象。2型糖尿病血管病变模型大鼠的胸主动脉内膜有明显损伤,连续性被破坏;内皮细胞部分脱落,细胞体积和细胞间的连接间隙增大;中膜平滑肌排列紊乱,内皮细胞受损。各给药组在治疗4周后,主动脉病变状况较模型组均有所减轻。2、尿液代谢组学研究在正离子模式下确定了7个与丹蛭降糖胶囊干预2型糖尿病血管病变的生物标志物:肌酸、肌酐、吲哚-3-羧酸、犬尿喹啉酸、尿酸、5-羟基-6-甲氧基吲哚葡萄糖醛酸和3-吲哚甲酸葡萄糖醛酸;负离子模式下确认了6个相关生物标志物:硫代糠、N-乙酰基-L-酪氨酸、硫酸雌酮、抗坏血酸-2-硫酸、2-苯乙醇葡萄糖醛酸和硫酸邻苯二酚。通过代谢通路的分析,丹蛭降糖胶囊可以通过改善2型糖尿病血管病变大鼠体内的糖代谢紊乱和氨基酸代谢紊乱,调节雌激素分泌,降低大鼠体内氧化应激状态,修复受损的肝肾功能来防治2型糖尿病血管病变。3、血清代谢组学研究在正离子模式下找到筛选出11个差异性标志物:甘油单酯、类花生酸类物质、L-苯丙氨酸、鹅去氧胆酸丁二酸酯、3种LPC类物质、1中LPE类物质、2种PC类物质以及异亮氨酸。负离子模式下筛选出4个差异性标志物:类花生酸类物质、甘油单酯、鹅去氧胆酸琥珀酸和胆酸。分析各差异性代谢物的代谢途径我们发现,丹蛭降糖胶囊可以调节2型糖尿病大鼠体内的氨基酸代谢、胆汁酸和脂代谢和氧化应激状态。丹蛭降糖胶囊可能通过上述途径来防治2型糖尿病早期的血管病变。结论:1、丹蛭降糖胶囊治疗2型糖尿病血管病变大鼠的药效学研究表明,丹蛭降糖胶囊对2型糖尿病大鼠的血管内皮细胞具有保护作用,对2型糖尿病引起的血管病变有防治作用。其作用机制可能是修复受损的血管内皮细胞,改善血管平滑肌的功能、调节抗凝/促凝和纤溶/促纤溶平衡有关。2、基于UPLC/QTOF-MS技术观察丹蛭降糖胶囊对2型糖尿病血管病变大鼠尿液代谢的影响的研究表明,丹蛭降糖胶囊防治2型糖尿病血管病变的作用机制可能与调节体内能量代谢、氨基酸代谢和氧化应激状态相关。3、基于UPLC/QTOF-MS技术观察丹蛭降糖胶囊对2型糖尿病血管病变大鼠血清代谢组学的研究表明,丹蛭降糖胶囊防治2型糖尿病血管病变的作用机制可能与调节体内氨基酸代谢、胆汁酸和脂代谢和氧化应激状态相关。综上所述,丹蛭降糖胶囊对高脂饲料喂养合并小剂量STZ诱导的2型糖尿病大鼠引起的早期血管病变具有防治作用,其作用机制在于调节能量代谢、氨基酸代谢、胆汁酸和脂代谢以及氧化应激状态有关。
