茶黄素类对炎性气道分泌型黏蛋白5AC的影响及其作用机制的研究

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是呼吸内科常见疾病,其发病率呈逐年增加趋势,是全世界引起慢性疾病和死亡的主要原因。在COPD的众多病理改变中,气道黏液高分泌是其重要的临床病理特征之一,过度分泌的黏液潴留于气道,进一步加重了业已狭窄气道的阻塞,直接导致了病情的恶化乃至死亡。气道黏液高分泌的结构基础被认为是慢性气道炎症致上皮杯状细胞的广泛化生和黏膜下支气管腺的增生,而在小气道,由于缺乏支气管腺增生的结构基础,其黏液高分泌主要由增生、化生的杯状细胞所贡献。 随着对气道黏液研究的深入,目前已发现20余种不同的黏蛋白基因。其中黏蛋白(mucin,MUC)5AC是气道主要的分泌型黏蛋白,在人气道上皮的杯状细胞中高度表达,也是病理性增加的主要黏蛋白表型。许多刺激因子均可促进黏液分泌,包括各种炎性介质如:IL-9、IL-1、TNF-α等;病原微生物及其产物、细胞蛋白如人中性粒细胞弹性蛋白酶(human neutrophil elastase ,HNE)和表皮生长因子受体配体;活性氧;空气污染物等能各自通过多种已知的信号转导通路,活化相关转录因子结合到黏蛋白5AC基因启动子上相应位点,促进转录,引起黏蛋白合成增加。HNE是一种极具潜能的黏液分泌促动剂,具有强的促MUC5AC合成和分泌功能,能通过表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)信号通路、氧化剂依赖机制、维A酸受体作用机制及直接增加MUC5AC mRNA稳定性等多种途径引起黏液增加,而EGFR途径是其最重要的信号通路之一。研究显示,表皮生长因子受体是一种受体酪氨酸激酶,在气道黏液高分泌的信号转导通路中居于中心地位。故抑制黏液高分泌状态的药物,能够有效预防和减缓COPD的病程。 茶黄素类是从红茶中提取的一类黄酮类化合物,其生物活性广范,包括抗炎、抗过敏、抗氧化、清除自由基、抗菌抗病毒及抗肿瘤等作用,虽然其作用机制还不完全清楚,但因其来源于植物,毒副作用小,故近年来国内外均在研究其药理作用,并拟用于临床。研究显示,茶黄素类的生物作用对肺部疾病的预防和治疗可起到积极的影响,可能成为治疗肺部疾病的有效途径。由于其对肿瘤的发生、发展有明显的抑制作用,并能诱导肿瘤细胞调亡,故国外文献称其为一种绿色的肿瘤生物防护制剂。目前用于抗肿瘤的EGFR阻断剂虽对黏液高分泌有下调作用,但价格昂贵,不易常规应用。茶黄素类能否对黏液的分泌起调控作用,各单体作用强度如何以及其作用途径未见报道。因此,本研究采用HNE刺激A549细胞构造炎性黏液高分泌模型,选用茶黄素类及其单体进行干预,使用各技术方法检测其对MUC5AC的影响,并通过测定各细胞转导因子,探讨其作用途径,进而为开发茶黄素类在COPD的预防和治疗方面的药物功效奠定基础。 实验分为三部分: 第一部分: 目的:首先采用树脂分离法提纯购买的茶黄素类粗品,使之纯度达到实验所需要求,并用聚酰胺层析柱分离茶黄素类得到茶黄素各单体。随后将提纯的茶黄素类加入HNE刺激的A549细胞中进行干预,检测其对MUC5AC的影响。 方法:采用树脂分离法提纯购买的40%纯度的茶黄素类(TFs)粗品,使之纯度达到80%以上,随后采用聚酰胺层析柱分离80%茶黄素类得到纯度均为80%以上的茶黄素(TF1)、茶黄素单没食子酸酯(TF2)、和茶黄素双没食子酸酯(TFDG;TF3)。接着解冻、培养人肺腺癌细胞株A549,用50nM的HNE刺激,建立HNE诱导的MUC5AC高表达的细胞实验模型。先将细胞分为6组: TFs 0mg/L组、TFs 50 mg/L组、TFs 100 mg/L组、TFs 200 mg/L组、TFs 300 mg/L组、TFs 400 mg/L组。采用四甲基偶氮唑盐光吸收法(MTT法)检测TFs对细胞活性的影响;确定作用剂量后,再将细胞分为4组进行实验,分别为:①对照组;②HNE( 50 nM )刺激组;③TFs(浓度分别为50、100、200 mg/L)干预组和④表皮生长因子受体(EGFR)阻断剂AG1478(5μM)干预组。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测MUC5ACmRNA的变化;酶联免疫吸附测定法(ELISA)定量分析MUC5AC蛋白含量的差异;细胞免疫化学以及激光共聚焦技术进一步直接观察MUC5AC蛋白表达的变化。 结果:MTT结果显示TFs对A549细胞活力的影响呈剂量依赖性。HNE刺激组的MUC5AC基因转录和蛋白表达水平明显高于对照组,其差异有统计学意义(P<0.01)。细胞免疫荧光结果显示MUC5AC蛋白定位于A549细胞胞浆,HNE刺激组表达较对照组明显增强。TFs各处理组MUC5AC基因转录和蛋白表达均较HNE刺激组显著减弱,且呈剂量依赖性,细胞免疫荧光结果也进一步证实了此结果。但其下调作用没有阻断剂组强。 结论:茶黄素类对A549细胞活性的影响随着浓度的加大而逐渐增强。茶黄素类能抑制HNE诱导的MUC5AC基因转录增强与蛋白过度合成,且呈剂量依赖性。证实了茶黄素类具有下调黏蛋白的功能,具有可开发价值。 第二部分: 目的:比较茶黄素类三个单体TF1、TF2、TF3在不同浓度对人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)诱导MUC5AC高分泌中的作用强度,以及TF3在不同作用时间MUC5AC的表达变化情况。 方法:仍先将细胞分为6组: 0mg/L组、50 mg/L组、100 mg/L组、200 mg/L组、300 mg/L组、400 mg/L组,采用四甲基偶氮唑盐光吸收法(MTT法)检测TF1、TF2、TF3对细胞活性的影响;之后将细胞分为4组:①对照组;②HNE( 50 nM )刺激组;③TF1、TF2、TF3(浓度分别为50、100、200 mg/L)干预组和④表皮生长因子受体(EGFR)阻断剂AG1478(5μM)干预组。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测MUC5ACmRNA的变化;酶联免疫吸附测定法(ELISA)定量分析MUC5AC蛋白含量的差异。 结果:MTT结果显示TF1、TF2、TF3对A549细胞活力的影响仍呈剂量依赖性,且TF3对细胞的损伤作用较TF1、TF2强。RT-PCR和蛋白定量分析结果示,给予TF1、TF2、TF3预处理后,与HNE刺激组比,两指标均明显下调(均P<0.01),且呈浓度剂量正相关,其中以TF3作用最明显。TF3的作用时间也与黏蛋白5AC的下调呈正相关。而阻断剂AG1478组对黏液的下调作用较茶黄素各组更强(P<0.01)。 结论:茶黄素类单体:TF1、TF2、TF3均能抑制HNE诱导的A549细胞MUC5AC的高表达状态,他们的抑制作用与浓度剂量、作用时间呈正相关,其中以TF3的下调作用最强。 第三部分: 目的:探讨茶黄素类对HNE诱导的MUC5AC高表达作用的细胞转导途径。 方法:以终浓度为200 mg/L的TF3作为研究对象,把A549细胞分为5组:对照组、HNE处理组、茶黄素类组、AG1478组和茶黄素+AG1478组。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组MUC5AC mRNA、EGFR mRNA的变化;Western免疫印迹法(Western blot)检测EGFR、P-EGFR、P-ERK1/2、P-p38和P-JNK蛋白的表达;酶联免疫吸附测定法观察MUC5AC蛋白表达的变化,细胞免疫化学以及激光共聚焦技术观察各处理组MUC5AC、P-EGFR蛋白表达的变化。 结果:茶黄素单体TF3干预后,RT-PCR测定MUC5AC mRNA和EGFR mRNA均较HNE刺激组明显下调,Western blot的结果也表明相应的EGFR和P-EGFR蛋白表达明显降低(均P<0.01);HNE刺激后P-ERK1/2和P-p38增强,以前者更为显著,P-JNK则无明显变化,茶黄素类及AG1478干预后P-ERK1/2和P-p38均有不同程度减弱(前者P<0.01;后者P<0.05)。 结论:茶黄素类可通过下调EGFR水平、减少EGFR的活化,部分阻遏EGFR信号转导途径,并通过细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)来实现对下游途径的影响,从而发挥其抑制炎性气道黏液高分泌形成的作用。