鱼藤酮诱导多巴胺能神经细胞损伤的机制研究

鱼藤酮（rotenone）是一种广泛使用的农药,近年来很多研究表明,鱼藤酮作为一种环境致病因子在帕金森病（Parkinson's disease,PD）的发病过程中发挥着重要作用。鱼藤酮是细胞线粒体呼吸链复合酶Ⅰ的特异性抑制剂,鱼藤酮的毒性作用主要是通过抑制线粒体呼吸链的功能引发活性氧（ROS）产生增多所致。PD是一种以中脑黑质致密部多巴胺能神经元进行性变性死亡为主要病理特征的神经系统变性疾病。而多巴胺能神经元较其他神经元或胶质细胞系更易受到鱼藤酮的毒性作用而发生变性死亡。SH-SY5Y细胞是来源于人的神经母细胞瘤,因其能产生和分泌多巴胺神经递质,已作为多巴胺能神经细胞广泛用于PD研究中。最新研究表明,DNA损伤诱导的神经元细胞周期关卡（check point）的异常调节导致多巴胺能神经元的变性丢失是PD等神经退行性疾病发生的重要分子基础之一。中枢神经系统（CNS）有丝分裂后神经元重新进入细胞周期是阿尔茨海默病（Alzheimer's disease,AD）神经元变性死亡的重要分子机制。可见,细胞周期调控异常与神经退行性疾病的发病过程密切相关,其重要作用正在受到越来越多人的关注。本研究的目的是观察并研究鱼藤酮对SH-SY5Y细胞和多巴胺能神经元细胞周期的影响及其作用机制,探讨鱼藤酮诱导多巴胺能神经细胞变性死亡的方式和机制,为PD的发病机制的研究提供新的思路。 本实验在鱼藤酮致SH-SY5Y细胞损伤模型上得到了如下结果。MTT法测定结果显示,鱼藤酮可以时间和剂量依赖性的降低细胞存活率,台盼兰拒染法结果显示,250 nM鱼藤酮呈时间依赖性增加的细胞死亡率,说明鱼藤酮引起了SH-SY5Y细胞的死亡。相差显微镜观察到,鱼藤酮引起细胞形态学改变,细胞突触缩回,形状变圆。Hoechst33258染色显示250 nM鱼藤酮诱导细胞出现了多核现象和凋亡样特征。用生化方法检测到250 nM鱼藤酮诱导的caspase-3活性增加。流式细胞仪检测发现,250 nM鱼藤酮组G2/M期细胞比例先增加后降低,并随后出现S期细胞比例增加和亚二倍体峰形成,提示鱼藤酮诱导细胞发生了短暂的G2/M期阻滞,G2/M期去阻滞后细胞从G2期进入M期发生了畸形有丝分裂,导致异倍体细胞出现,形成亚二倍体峰细胞死亡。用Western blotting检测到胞浆内细胞周期调控蛋白cyclin B1、磷酸化细胞分裂周期蛋白p-cdc2（Tyr15）的表达先增加,分别在250 nM鱼藤酮处理6 hr和24 hr时达到高峰,之后表达降低,与细胞短暂性G2/M期阻滞相平行,说明250 nM鱼藤酮诱导了G2/M期关卡调节子cyclin B1-p34cdc2复合物活性改变,从失活状态转变为活化状态,从而调节G2/M期关卡从阻滞变为去阻滞。检测发现p53蛋白表达呈时间依赖性增加,提示鱼藤酮可能通过依赖于p53途径诱导G2/M期关卡的异常调节而致细胞的死亡。结论:鱼藤酮诱导了SH-SY5Y细胞周期关卡的异常调节致使细胞发生死亡,可能是鱼藤酮诱导SH-SY5Y多巴胺能神经元变性死亡的分子机制。 本实验还观察了鱼藤酮对在体黑质多巴胺能神经元的损伤作用,并观察了鱼藤酮对黑质多巴胺能神经元细胞周期的影响。我们采用大鼠黑质单侧注射鱼藤酮的方法建立动物模型,用苯丙胺诱导转圈实验筛选合格模型,用流式细胞仪技术分析鱼藤酮损伤后的黑质多巴胺能神经元的细胞周期的分布情况,发现鱼藤酮组神经元S期细胞比例明显增加,提示鱼藤酮可能诱导了黑质多巴胺能神经元再次进入细胞周期S期,而这有可能是导致有丝分裂后神经元死亡的机制。动物模型上观察到的结果确证了鱼藤酮对多巴胺能神经元的细胞周期的作用。 手掌参是一种传统藏药,具有补益气血、安神增智等功效,CE是从其块茎中提取得到的有效部位,4ab、4c、4e、4f是CE中的4个活性单体化合物。本课题组以前的实验结果表明,CE和4ab对H2O2、Aβ等造成的细胞损伤都有很好的神经保护作用。本实验在研究鱼藤酮致SH-SY5Y细胞损伤作用的基础上进一步评价CE 4个活性单体化合物对鱼藤酮引起的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用。结果显示,4ab对鱼藤酮引起的细胞存活率降低有不同程度的保护作用,对鱼藤酮引起的LDH漏出有不同程度的抑制作用,表明4ab对鱼藤酮引起的神经细胞损伤具有一定的保护作用。