陈化烟叶表面有益微生物的分离筛选、鉴定及应用研究

生物多样性是人类社会赖以生存和发展的基础。特殊环境或极端环境中微生物资源的开发和利用已成为近年来的研究热点。作为世界上烟草种植和消费的第一大国，我国陈化烤烟表面微生物多样性的研究基本处于空白状态。因此，针对我国主产烟区陈化烟叶表面微生物区系构成和生防菌株、降解致癌物质TSNA菌株的筛选鉴定和应用进行了深入系统研究。 采用常规分离筛选方法于14种陈化烟叶表面分离筛选得到1618株微生物，其中包括1279株细菌（Bacterium），226株放线菌(Actinomycetes)，75株真菌(Fungus)和38株酵母菌(Yeast)。陈化烟叶表面微生物的种类和数量随着陈化时间的延长而减少，优质烟叶表面微生物的种类和数量多于劣质烟叶。不同等级、陈化时间和不同发酵条件下烟叶表面微生物的种类和数量存在较大差异。由此可知环境因子对烟叶陈化发酵起到至关重要的作用。 本研究首次尝试于陈化烟叶表面微生物菌库中分离生防菌株，其中BC79对5种供试烟草常见病原真菌均表现较好的抑菌能力。基于菌株形态特征、理化特性和16S rDNA序列分析，确定BC79（Genbank accession number：JF449444）为甲基营养型芽孢杆菌Bacillu methylotrophicus。本研究中首次报道了该芽孢杆菌对植物病原真菌有较强的生防能力。B. methylotrophicus BC79对烟草灰霉病原菌丝生长和孢子萌发均产生明显的抑制作用，表明BC79在生长代谢过程中可能产生了对烟草灰霉病原菌菌丝生长和抑孢子萌发产生强烈抑制作用的活性物质。BC79生长发酵条件优化和抗逆性研究利于其最大抑菌能力的挖掘。其中蔗糖、蛋白胨是BC79生长的最佳碳源、氮源，TSA是较适合BC79生长和发挥抑菌能力的培养基，于pH7.0，170r/min，30oC培养48h时BC79对烟草灰霉病原菌的抑制效果最好。BC79生长旺盛，抗逆性强，抗紫外，定殖能力和遗传性能稳定。温室防效表明BC79发酵液对烟草灰霉病具有较好的防治作用，且对烟苗有一定促生作用。上述研究表明生防菌株BC79具有较大的应用价值和开发潜力。 采用富集驯化法于菌库中筛选高效转化硝酸盐和亚硝酸盐的菌株，其中SM+DM1、DM2+BTB2个培养基组合筛选得到的目标菌株较多，确定其是筛选反硝化细菌的较佳组合。本研究发现依据BTB培养基颜色变化分离筛选反硝化细菌是一种有效可行的途径。高效转化硝酸盐的菌株AS97经鉴定为荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens（Genbank accession number: JF449445）。确定AS97菌悬液处理陈化烟叶的最佳接种量是5%，发酵的较佳温度和相对湿度是30℃和60%。该环境条件下，菌株对硝酸盐、亚硝酸盐和TSNA的降解能力较强，相关性分析表明上述3种物质的含量呈极显著相关，因此推断硝酸盐、亚硝酸盐是TSNA的主要前体物质。评吸结果表明菌株AS97菌悬液对烟叶品质具有较好的促进作用，说明AS97在降解TSNA中具有较大的应用价值和开发潜力。菌株AS97在整个生长过程中对硝酸盐的转化能力与菌体生长成正比关系。AS97的抗逆性较好，生长温度和pH范围较宽，本研究探索了其最佳生长温度和pH，为高效降解TSNA的菌株AS97进一步的生产实践应用奠定了坚实基础。