自噬在晚期糖基化终产物诱导的软骨细胞凋亡中的作用

背景及目的:骨关节炎是以关节软骨变性、软骨组织破坏以及关节周围骨质增生为特征的慢性致残性疾病,其病因和发病机制仍在探索中。目前的研究显示,软骨细胞的过度凋亡、细胞外基质的降解等是该病发生的重要因素。晚期糖基化终产物是蛋白质、氨基酸、脂类或核酸等大分子物质的游离氨基在非酶条件下与还原糖的醛基经过缩合、重排、裂解、氧化修饰后产生的一组稳定的终末产物。自噬是细胞内被破坏的大分子蛋白质及受损的细胞器等成分被包裹运送至溶酶体降解的过程,是细胞在受到应激性的死亡威胁时保持存活、维持稳态、实现更新的一种机制。研究发现,随着年龄的增长,晚期糖基化终产物在人体关节软骨内的蓄积与骨关节炎的发病密切相关。同时有研究显示,自噬对于骨关节炎的发生发展具有抵御作用。然而,目前晚期糖基化终产物与自噬在骨关节炎的发病中的共同影响及作用机制鲜有报道。本课题通过体外细胞培养的方法,探索晚期糖基化终产物对软骨细胞的损伤作用及可能机制,并通过雷帕霉素诱导软骨细胞自噬,研究自噬在晚期糖基化终产物所致的软骨细胞凋亡中的作用,以期能为骨关节炎的预防和治疗提供新的理论依据。方法:第一部分:晚期糖基化终产物对体外培养的软骨细胞的损伤作用及可能机制研究。从5位实施全膝关节置换术的骨关节炎患者的关节软骨中通过两步酶消化法分离软骨细胞,体外培养传代,培养过程中绘制每一代软骨细胞的生长曲线,并用甲苯胺蓝染色和II型胶原免疫组织化学染色对软骨细胞进行鉴定。通过预实验选择晚期糖基化终产物(AGEs)对软骨细胞的最佳刺激时间和最佳刺激浓度,然后软骨细胞用AGEs干预,MTT法检测软骨细胞活性,实时荧光定量PCR法测定软骨细胞TNF-α和NF-κB表达的影响,荧光探针法检测软骨细胞活性氧的产生,Annexin V-FITC/PI法检测软骨细胞凋亡。第二部分:自噬在晚期糖基化终产物诱导的软骨细胞凋亡中的作用研究。从5位实施全膝关节置换术的骨关节炎患者的关节软骨中分离和体外培养得到软骨细胞,未处理组软骨细胞加BSA至终浓度为100ug/ml继续培养12小时,AGEs组软骨细胞加AGE-BSA至终浓度为100ug/ml继续培养12小时,雷帕霉素组软骨细胞加雷帕霉素至终浓度为1mmol/L培养2小时,再加AGE-BSA至终浓度为100ug/ml继续培养12小时。MTT法检测软骨细胞活性,Western blot检测反应自噬水平的II型微管相关蛋白轻链3(LC3-II)的蛋白表达,实时荧光定量PCR法测定软骨细胞TNF-α和NF-κB的表达,荧光探针法检测软骨细胞ROS的产生,Annexin V-FITC/PI法检测软骨细胞凋亡。结果:第一部分:晚期糖基化终产物对体外培养的软骨细胞的损伤作用及可能机制研究。综合分析软骨细胞的生长曲线,甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,结果发现第4代以后软骨细胞增殖能力开始下降,生长曲线比较平坦,且细胞分泌氨基多糖和合成Ⅱ型胶原的能力也显著下降,所以本实验选择第2-4代对数生长期的软骨细胞进行实验。通过预实验得出软骨细胞AGEs最佳刺激浓度为100ug/ml,最佳刺激时间为12小时。未处理组软骨细胞加入BSA至终浓度为100ug/ml后培养12小时,AGE组细胞加AGE-BSA至终浓度为100ug/ml后培养12小时。MTT法检测结果显示,与未处理组比较,AGEs组软骨细胞活性显著降低(P<0.01)。定量RT-PCR检测结果显示,与未处理组比较AGEs组软骨细胞TNF-α和NF-κB的表达显著上升(P<0.01)。荧光探针法检测结果显示,AGEs组软骨细胞ROS的产生和积累较未处理组显著增加(P<0.01)。Annexin V-FITC/PI法检测结果显示,未处理组软骨细胞凋亡少见,AGEs组软骨细胞凋亡显著增加(P<0.01)。第二部分:自噬在晚期糖基化终产物诱导的软骨细胞凋亡中的作用研究。MTT法检测结果显示,与未处理组相比,AGEs组和AGEs+雷帕霉素组软骨细胞活性均显著下降(P<0.01);与AGEs组相比,AGEs+雷帕霉素组软骨细胞活性明显升高(P<0.05)。Western blot测定结果显示,未处理组与AGEs组软骨细胞LC3-II的表达均较低,差异无显著意义;与未处理组和AGEs组相比,AGEs+雷帕霉素组软骨细胞LC3-II的表达显著增加(P<0.01)。定量RT-PCR检测结果显示,AGEs+雷帕霉素组较AGEs组软骨细胞TNF-α和NF-κB的表达明显下降(P<0.01和P<0.05),但仍显著高于未处理组(P<0.01)。荧光探针法检测结果显示,AGEs+雷帕霉素组较AGEs软骨细胞ROS含量明显下降(P<0.01),但仍显著高于未处理组(P<0.05)。Annexin V-FITC/PI法检测结果显示,AGEs组和AGEs+雷帕霉素组软骨细胞的凋亡均较未处理组显著增加(P<0.01);但与AGEs组相比,AGEs+雷帕霉素组软骨细胞凋亡明显减少(P<0.01)。结论:本研究建立了两步酶消化分离软骨细胞、软骨细胞原代和传代培养、甲苯胺蓝染色和II型胶原免疫组织化学染色鉴定软骨细胞的方法,并通过综合分析生长曲线、甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色结果确定了软骨细胞实验代次,选择第2-4代对数生长期的软骨细胞进行实验。晚期糖基化终产物干预后可以通过促进软骨细胞凋亡、降低软骨细胞活性从而导致软骨细胞损伤,其机制与晚期糖基化终产物诱导的ROS产生的增加、TNF-α和NF-κB表达的升高有关。自噬可以通过减少ROS的产生、降低TNF-α和NF-κB的表达、以及抑制软骨细胞的凋亡等途径增加软骨细胞活性,减轻或缓解晚期糖基化终产物对软骨细胞的损伤。