脑缺血预处理对脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制

第一部分脑缺血预处理在大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用及其与TNF-α和iNOS的关系 目的探讨脑缺血预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及其与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的关系。 方法线栓法制作大鼠右大脑中动脉阻塞(MCAO)的局灶性脑缺血模型。在此模型上,脑缺血预处理+脑缺血再灌注组(IP+R组)大鼠先予脑缺血预处理即MCAO 10 min再灌注72 h后,再予脑缺血90 min再灌注24 h。评估神经功能缺失和脑梗死体积,免疫组化法检测右脑组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达。 结果与假脑缺血预处理+脑缺血再灌注组(R组)大鼠相比,IP+R组大鼠神经功能缺失明显减轻(P <0.01),脑梗死体积明显减少(P<0.01),TNF-α和iNOS的表达也明显减少(P<0.01)。 结论脑缺血预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用,其机制可能是抑制缺血再灌注脑组织表达TNF-α及iNOS从而减轻炎症免疫损伤。 第二部分脑缺血预处理降低大鼠缺血再灌注脑组织一氧化氮含量 第一节一氧化氮与脑缺血再灌注损伤 目的探讨大鼠脑缺血再灌注后脑组织NO含量的改变、作用及药物(依达拉奉)干预效果。 方法线栓法制作大鼠大脑中动脉阻塞的局灶性脑缺血模型;脑缺血40 min后予再灌注;在再灌注开始时,脑缺血再灌注加依达拉奉组大鼠即予静脉注射依达拉奉(Edaravone),缺血再灌注组及假手术组均静脉注射等体积的生理盐水;脑缺血再灌注24 h后,用Bederson神经缺损体征评分法评估大鼠神经功能缺损,用亚硝酸盐还原法测定脑组织中NO的含量。 结果(1)脑缺血再灌注24 h后,缺血再灌注加依达拉奉组大鼠的神经功能障碍明显轻于缺血再灌注组大鼠(P <0.01);(2)脑缺血再灌注24h后,脑缺血再灌注组大鼠缺血侧和自身对照侧皮层及海马NO含量与假手术组大鼠相比明显升高,差异有统计学意义(P <0.01);脑缺血再灌注加依达拉奉组大鼠缺血侧和自身对照侧皮层及海马NO含量与脑缺血再灌注组大鼠相比明显降低,差异有统计学意义(P <0.01)。 结论大鼠脑缺血再灌注后脑组织NO含量增加,NO参与脑缺血再灌注损伤;依达拉奉对大鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用,其机制可能是降低了脑组织的NO水平。 第二节脑缺血预处理对大鼠缺血再灌注脑组织一氧化氮的影响 目的探讨脑缺血预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用与脑组织一氧化氮(NO)的关系。 方法线栓法制作大鼠右大脑中动脉阻塞(MCAO)的局灶性脑缺血模型。在此模型上,缺血预处理大鼠先予脑缺血预处理即MCAO 10 min再灌注72 h后,再予脑缺血90min后再灌注24h,用Bederson神经缺损体征评分法评估大鼠神经功能缺损,用亚硝酸盐还原法测定脑组织中NO的含量。 结果脑缺血90min再灌注24h后,脑缺血预处理+脑缺血再灌注组(IP+R组)大鼠的神经功能缺损体征明显轻于假脑缺血预处理+脑缺血再灌注组(R组)(P <0.05);R组和IP+R组的缺血侧和自身对照侧皮层、海马的NO含量显著升高,与假脑缺血预处理+假脑缺血再灌注组(S组)相比差异均有统计学意义(P <0.01);IP+R组缺血侧和自身对照侧皮层、海马的NO含量较R组明显下降,差异有统计学意义(P <0.01)。 结论脑缺血预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用,其机制可能是降低了脑组织的NO水平。 第三部分14-3-3蛋白在脑缺血预处理保护脑缺血再灌注损伤中的作用及机制 目的探讨14-3-3蛋白在脑缺血预处理保护脑缺血再灌注损伤中的作用及机制。 方法(1)免疫组化检测14-3-3蛋白各种亚型(β、γ、ε、ζ、η和θ)在原代培养的大鼠海马神经元的分布。(2)线栓法制作大鼠右大脑中动脉阻塞(MCAO)的局灶性脑缺血模型。在此模型上,缺血预处理大鼠先予脑缺血预处理即MCAO 10 min再灌注72 h后,再予脑缺血90min后再灌注24h;随后,免疫组化检测14-3-3蛋白在各组大鼠缺血再灌注侧海马表达、Western blot检测14-3-3蛋白、Bad、p-Bad及p-Akt在各组大鼠缺血再灌注侧海马表达,Tunel法检测各组大鼠缺血再灌注侧海马神经元凋亡。 结果14-3-3蛋白各亚型(β、η、γ、ε、θ和ζ亚型)在原代培养的大鼠海马神经元中均有表达;各组大鼠经脑预缺血10min-再灌注72h-脑缺血90min-再灌注24h步骤后,免疫组化结果显示:脑缺血预处理+脑缺血再灌注组(IP+R组)大鼠缺血再灌注侧海马神经元14-3-3蛋白表达明显高于假脑缺血预处理+脑缺血再灌注组(R组)和假脑缺血预处理+假脑缺血再灌注组(S组)(P <0.01)。大鼠缺血再灌注侧海马Western blot检测结果表明:(1)IP+R组14-3-3蛋白表达明显高于R组和S组(P <0.01),R组14-3-3蛋白表达高于S组(P <0.01)。(2)Bad在R组表达升高,高于S组和IP+R组(P <0.01);但是,Bad在S组和IP+R组表达差异无统计学意义(P =0.065)。(3)IP+R组p-Bad表达明显高于R组和S组(P <0.01),R组p-Bad表达高于S组(P <0.05)。(4)IP+R组p-Akt表达明显高于R组和S组(P <0.01),R组p-Akt表达高于S组(P <0.05)。(5)IP+R组p-Bad/Bad的比值大于R组和S组,而且,S组p-Bad/Bad的比值大于R组。IP+R组大鼠缺血再灌注侧海马CA1区TUNEL阳性细胞数明显少于R组(P <0.01)。 结论14-3-3蛋白各种亚型(β、γ、ε、ζ、η和θ)在大鼠海马神经元均有表达。脑缺血预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用,其可能机制是脑缺血预处理诱导脑缺血再灌注大鼠脑组织14-3-3蛋白上调表达,激活PI3K/Akt信号转导途径,使p-Akt和p-Bad上调表达,14-3-3蛋白与p-Bad结合抑制了Bad所引起的细胞凋亡而减轻大鼠脑缺血再灌注损伤。