天冬氨酰-（天冬酰胺酰）-β-羟化酶在肝纤维化进程中作用及机制的初步研究

【研究目的】探索天冬氨酰-(天冬酰胺酰)-β-羟化酶(ASPH)能否促进肝纤维化的发生、发展,并阐明其信号调控网络及机理。【研究方法】首先利用野生型小鼠分别建立胆总管结扎(Bile Duct Ligation,BDL)或四氯化碳(Carbon Tetrachloride,CCl4)诱导的肝纤维化模型,观察ASPH在不同机制的肝纤维化发展过程中其表达量以及可能影响的下游信号通路的变化情况;接着利用CRISPR/Cas9技术构建的ASPH酶活性敲除小鼠(ASPHdel型小鼠)并进行验证;随后利用野生型小鼠与ASPHdel型小鼠建立BDL诱导的肝纤维化模型,组间进行比较,观察不同基因型小鼠在此类肝纤维化模型中肝纤维化程度的差异以及炎症、纤维化相关信号通路与Notch信号通路的变化情况;最后,利用仿制的ASPH酶活性小分子抑制剂(MO-I-1100),在野生型小鼠中分别建立BDL或CCl4诱导的肝纤维化模型,观察同一种肝纤维化模型中对照组与给药组小鼠肝纤维化程度的差异以及炎症、纤维化相关信号通路与Notch信号通路的变化情况。【研究结果】野生型小鼠BDL诱导的肝纤维化模型中血清ELISA检测结果显示手术组小鼠血清中ASPH含量较对照组明显升高(P<0.01);野生型小鼠CCl4诱导的肝纤维化模型中PCR检测结果显示建模3周以及建模12周的给药组小鼠肝脏中ASPH的m RNA水平与蛋白水平均较对照组明显升高,建模3周的给药组小鼠肝脏组织Jagged-2的蛋白水平较对照组降低。鼠尾检测以及肝脏WB实验结果提示ASPHdel型小鼠构建成功。BDL诱导的ASPHdel型小鼠肝纤维化模型中,PCR检测结果提示手术组ASPHdel型小鼠肝脏的CollagenαⅠ(P<0.05)、TIMP-1(P<0.05)、MMP-2(P<0.01)、α-SMA(P<0.05)以及TGF-β1(P<0.05)的m RNA水平较野生型小鼠明显降低;WB实验结果显示ASPHdel型小鼠肝脏组织Jagged-2的蛋白水平较野生型小鼠稍有升高,ASPHdel型小鼠肝脏组织中IL-1β、TNF-α炎症因子的蛋白水平较野生型小鼠降低;天狼猩红染色结果显示其Ⅰ型胶原的区域面积较野生型小鼠明显减小;HE染色结果显示ASPHdel型小鼠的肝脏组织出现大范围坏死。在应用MO-I-1100的CCl4诱导(12周)肝纤维化治疗模型中,治疗组小鼠肝组织中的CollagenαⅠ、TIMP-1、MMP-2、Jagged-2(P<0.05)、Notch-3、IL-1β和TNF-α的m RNA水平较对照组有下降趋势。【结论】ASPH的羟化酶活性可能加速肝纤维化进展,其机制可能是其通过负调控Jagged-2蛋白水平,从而上调相关炎症基因的转录水平,最终促进了肝星形细胞的活化,增强了细胞外基质的分泌和沉积。