目的
研究具有益气解毒功效的牛黄参(牛黄、西洋参)含药血清对大鼠肝干细胞系WB-F344的增殖、凋亡及分化过程中相关细胞因子及受体表达的影响,探讨益气解毒法对肝干细胞的作用机制,以便从分子生物学水平来阐释益气解毒法治疗慢性肝病的作用原理,为进一步研究治则治法提供新的思路,也为临床推广应用提供理论与实验依据。
方法
1.含药血清的制备：体外培育牛黄、西洋参配伍组采用传统水煎法灌胃动物制作含药血清(简称水煎组)；依据现代药理药效研究,提取西洋参中具有抗疲劳作用的西洋参皂甙,总皂甙类成分,提取体外培育牛黄中具有保护肝细胞、恢复肝功能、利胆退黄作用的胆红素、胆酸、去氧胆酸、牛磺酸类成分制成牛黄参胶囊,后胶囊取粉稀释使用灌胃动物制作含药血清(简称成分组)。水煎组和成分组在实验中互为对照组。将大鼠分为空白组、水煎组、成分组,每组各16只。各组给相应的药物连续灌胃7天(1次／d),给药浓度为：含牛黄生药浓度3.6g/L,含西洋参生药浓度21.6g/L,大鼠按体重100g灌胃1mL的量给药,空白组灌胃等量的生理盐水,连续一周。末次给药后2h进行大鼠颈动脉取血,将采集的血液在室温中静置4h,3000rpm,离心15min,收集血清,将收集的血清在56℃水浴30min进行灭活,而后在超净台内用注射滤器(0.22μm微孔滤膜)过滤除菌,分装成小瓶于-20℃保存备用,需要时用培养液配制成所需浓度的含药血清。
2.WB-F344细胞的培养：用50mL的培养瓶,将WB-F344接种于含10%胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、100U/mL青霉素及链霉素的高糖DMEM培养基中,细胞浓度为2×104个／mL,置于5％CO2、37℃的培养箱中培养。细胞换液时间为2-3天,3-5天传代,0.25%胰蛋白酶消化后1：2传代。
3.益气解毒法对WB-F344增殖的影响：取对数生长期细胞用胰酶消化,调密度为1×105／mL,接种于96孔细胞培养板,37℃、5%CO2条件下培养24h后,分别加入浓度为5%、10%、20%的成分组与水煎组药物血清,空白对照组加入相同浓度梯度的正常大鼠血清,正常对照组则加入等量的培养液,正常培养基培养。各组血清作用24h后,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定细胞的增殖状况,选取增殖的最佳药物血清浓度,后续实验均以此浓度进行研究。
4.益气解毒法对WB-F344HGFR、EGF、EGFR、TGF-β1R和TGF-β2R表达的影响：血清分为正常对照组(10%胎牛血清)、空白对照组(10%正常大鼠血清)、成分组(10%成分剂血清)、水煎组(10%水煎剂血清),各组血清作用细胞24h后,裂解细胞,提取细胞的总蛋白,蛋白印迹法(Western-blot)测定各组WB-F344细胞的HGFR、EGF、EGFR、TGF-β1R和TGF-β2R的表达情况。
5.益气解毒法对WB-F344AFPmRNA、ALBmRNA表达的影响：取对数生长期细胞,调密度为5x103/mL,接种于96孔细胞培养板,8h后换分化培养体系(高糖DMEM、10%胎牛血清、HGF50ng/mL、EGF20ng/mL、胰岛素1μg/mL地塞米松1μmol/L),加入10%成分组和水煎组的含药血清,并设立正常和空白血清对照孔,前者加入正常培养液,后者加入10%正常大鼠血清。于0、7、10、14、21d分别收集分化培养细胞,抽提总RNA,逆转录聚合酶链式反应法(RT-PCR)检测肝干细胞标志物甲胎蛋白(AFP)及肝细胞标志物白蛋白(ALB)的mRNA表达量,实验过程中注意观察含药血清刺激后细胞形态的变化。
6.益气解毒法对WB-F344凋亡的影响：调整细胞密度为1x106/mL,置于培养板,37℃、6小时静置,待细胞贴壁后加入浓度为40ng/mL的转化因子β,再分别加入各组血清干预,血清仍分为正常对照组(10%胎牛血清)、空白对照组(10%正常大鼠血清)、成分组(10%成分剂血清)、水煎组(10%水煎剂血清),待作用细胞24h后,Annexinv-FITC和PI染色,流式细胞仪测定并分析数据。
结果
1.益气解毒法对WB-F344增殖的影响：10%、20%浓度的牛黄参含药血清成分组和水煎组均能促进WB-F344细胞的增殖,与空白、正常对照组比较OD值显著升高(P<0.01)；且10%为细胞增殖的最佳浓度梯度；各组含药血清均未表现出对细胞的毒性作用,镜下观察各组细胞生长良好。
2.益气解毒法对WB-F344HGFR、EGF、EGFR、TGF-β1R和TGF-β2R表达的影响：经10%牛黄参含药血清成分组和水煎组干预后,WB-F344细胞HGFR、EGF、EGFR、TGF-β1R和TGF-β2R的表达量较空白、正常对照组明显升高,有统计学意义(P<0.01)；且部分指标成分组优于水煎组(P<0.05)。
3.益气解毒法对WB-F344AFPmRNA、ALBmRNA表达的影响：经10%牛黄参含药血清成分组和水煎组干预后,WB-F344肝干细胞表面标志物AFPmRNA的表达量在细胞分化过程中随着时间的延长逐渐减少,肝细胞表面标志物ALB mRNA的表达量则逐渐增多(P<0.01)；且成分组优于水煎组(P<0.05)。
4.益气解毒法对WB-F344凋亡的影响：经10%牛黄参含药血清成分组和水煎组干预后,WB-F344细胞的凋亡率与空白、正常对照组相比显著下降(P<0.01),且成分组优于水煎组(P<0.05)。
结论
1.益气解毒法可以促进肝干细胞WB-F344的增殖,对细胞未表现出明显的毒性作用。
2.益气解毒法可以促进肝干细胞WB-F344细胞因子HGFR.EGF.EGFR. TGF-β1R和TGF-β2R的表达量上调。
3.益气解毒法可以通过细胞因子体系诱导肝干细胞WB-F344向肝细胞特异性方向的分化。
4.益气解毒法具有拮抗肝干细胞WB-F344凋亡的作用。
5.益气解毒法所选中药复方随剂型的不同,疗效亦有一定的差异,本实验中成分剂牛黄参胶囊较牛黄参水煎剂效果更好。
