CCR3及其配体Eotaxin在类风湿关节炎中的表达和意义

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以慢性破坏性多发关节炎为主要表现的全身性自身免疫性疾病,其基本病理变化是自身免疫异常引起的致炎细胞因子和炎症介质等释放,以及由此导致的滑膜炎和骨质破坏。从大量基于类风湿关节炎患者和关节炎动物模型的研究中,已知多种趋化因子及其受体参与了炎性细胞招募进入关节滑膜组织的过程。前炎趋化因子的作用强于稳态趋化因子的作用,加速了滑膜炎症的进展,在类风湿关节炎的发生和病理进展中起到了重要的作用。 CCR3最早被发现表达在嗜酸性粒细胞表面,是一种七次跨膜偶联蛋白受体,属CC类趋化因子受体家族。后逐渐发现CCR3在嗜碱粒细胞、Th2细胞、树突状细胞及肥大细胞表面、某些组织细胞如呼吸道上皮细胞、血管内皮细胞等亦有表达。CCR3的9种趋化因子配体分别为RANTES (CCL5)、MCP-2(CCL7)、MCP-3(CCL8)、Eotaxin (CCL11)、MCP-4(CCL13)、HCC-2(CCL15)、Eotaxin-2(CCL24)、Eotaxin-3(CCL26)及MEC (CCL28),其中作用最强的配体是嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin/CCL11)。 CCR3是Eotaxin的唯一受体,Eotaxin是唯一通过CCR3进行信号识别的趋化因子。这说明Eotaxin对表达CCR3的细胞具有选择性。Eotaxin与CCR3结合后,可激活MAP激酶、磷脂酶A2、磷脂酰肌醇-3激酶、蛋白激酶C、信号传导和转录激活因子(STAT),导致细胞内Ga+内流、肌动蛋白聚合,起到活化蛋白酶、释放活性氧等作用。 Eotaxin含有73个氨基酸残基,是一种β2趋化因子,CC趋化因子家族的成员。嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、内皮细胞、肠上皮细胞、呼吸道上皮细胞、软骨细胞、平滑肌细胞及角质细胞等多种细胞均可产生Eotaxin。细胞因子如IL-4、IL-13、TNF-α等也可通过PI3K、 ERK、 p38等MAPK信号通路诱导嗜酸性粒细胞上Eotaxin的表达。因为Eotaxin可以通过与CCR3的特异性结合吸引其表达细胞向炎症部位聚集并激活,传统研究认为,它主要在以嗜酸粒细胞为主的炎症中起作用。 既往有研究发现,幼年特发性类风湿关节炎和早期类风湿关节炎患者血清中Eotaxin的水平较健康正常人、银屑病关节炎或强直性脊柱炎患者均明显增高,而外周血中表达CCR3的CD4+T淋巴细胞、单核细胞数量明显降低。前炎细胞因子可以刺激关节炎软骨细胞释放MCP-4/CCL13,而Eotaxin可促进关节炎软骨细胞的MMPs表达和分泌。动物实验中的研究结果也证实,CCR3在招募白细胞进入炎症关节的滑膜组织中发挥作用。近年来有研究发现,在内皮细胞、肿瘤细胞上也有CCR3表达升高,并在血管生成、细胞迁移及侵袭能力等相关方面发挥作用。作为类风湿关节炎病理机制中的核心细胞,既往研究表明成纤维样滑膜细胞具有分泌包括Eotaxin在内的趋化因子的能力,但成纤维样滑膜细胞是否有趋化因子受体CCR3的功能性表达尚不明确。 综上所述,CCR3及其配体Eotaxin参与了关节炎症反应,并可能在关节炎症的发生发展中起到重要的作用。但CCR3及其配体,尤其是Eotaxin这一特定配体在炎症关节中的表达情况和参与炎症反应的作用机制仍不清楚；而作为类风湿关节炎核心细胞的成纤维样滑膜细胞,CCR3是否在RAFLS上表达、又发挥了怎样的作用未见报道。深入了解CCR3在类风湿关节炎中的表达和分布情况,并进一步研究其在成纤维样滑膜细胞上的表达和作用,有助于我们更好的理解趋化因子及趋化因子受体在关节炎症中发挥的重要作用,并可能为进一步的临床治疗研究提供思路和参考。 第一部分CCR3在RA患者外周血和滑膜组织中的表达 背景：既往研究在RA患者的外周血和滑膜组织中均检测到CCR3表达,但在不同细胞群之间CCR3表达分布差异及成纤维样滑膜细胞表面是否表达CCR3尚不明确。 方法：应用流式细胞术方法检测患者膝关节滑膜组织单细胞悬液(RA、n=16, OA、n=18)和患者外周血(RA、n=8,OA、n=8)中CD4+、CD8+T淋巴细胞群表面CCR3的表达及分布；滑膜组织单细胞悬液中成纤维样滑膜细胞表面CCR3的表达,初步探讨CCR3在RA发生发展中可能的作用和意义。 结果：RA患者关节滑膜组织单细胞悬液中,CD4+CCR3+细胞比例较OA降低(P<0.05)；RA患者外周血淋巴细胞中,CD8+CCR3+细胞比例较OA患者降低(P<0.05),与既往文献报道结果一致。RA患者滑膜组织中CD4+CD25+Foxp3+CCR3+细胞比例较OA也降低(P<0.05),在外周血淋巴细胞中则无明显差别；这一结果未见既往文献提及,为首次报道。在外周血和滑膜组织的CD4+IL-4+、CD4+IFN+、CD4+IL-17+、CD4+IL-22+等CD4+T淋巴细胞中,CCR3+的细胞比例在RA和OA患者之间均未见明显差异。首次报道在RA和OA患者的成纤维样滑膜细胞表面均表达CCR3,且RAFLS较OAFLS表达CCR3细胞比例升高(P<0.05)。 结论：CCR3及其趋化因子配体可能在RA关节中不同细胞群均有表达,可能在关节破坏的病理过程中起到了重要作用。 第二部分CCR3及其配体Eotaxin对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞迁移及侵袭能力的影响 背景：关节滑膜是类风湿关节炎病理发生和发展的主要靶组织,成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocyte, FLS)在RA病理中起着最为重要的作用。Eotaxin和CCR3不仅在炎性细胞招募中起到重要的作用,还参与了肿瘤细胞、内皮细胞的迁移及侵袭过程。测定TNF-α、IL-1β等前炎因子对FLS分泌Eotaxin的影响,以及Eotaxin通过与CCR3的相互作用进一步调控RAFLS的MMP2、MMP9分泌,并对其迁移和侵袭能力产生的影响。从而进一步探讨Eotaxin及其受体CCR3在RA关节滑膜炎症、软骨破坏及骨侵蚀中所起的作用。 方法：培养原代类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞。不同浓度的TNF-α IL-1β (0.1、1、10、100ng/m1)刺激成纤维样滑膜细胞并分别在不同时间点(2、12、24小时)收集标本。Real time-PCR检测CCR3、Eotaxin的mRNA表达；ELISA检测细胞培养上清中Eotaxin、eotaxin-2及eotaxin-3的浓度。免疫荧光双标观察CCR3在成纤维样滑膜细胞表面的表达。不同浓度的Eotaxin (50、100、200ng/ml)分别刺激成纤维样滑膜细胞,Real time-PCR检测CCR3、MMP2、MMP9的mRNA表达；Transwell实验观察Eotaxin对成纤维样滑膜细胞的迁移和侵袭能力的影响。 结果：不同浓度的TNF-α、IL-1β均可显著促进RAFLS中CCR3的mRNA表达(P<0.05)及细胞表面CCR3表达、Eotaxin分泌增加。不同浓度的Eotaxin可促进RAFLS表达CCR3、MMP2及MMP9mRNA增加(P<0.05),并提高RAFLS的迁移和侵袭能力。CCR3阻断剂SB328437可抑制Eotaxin促进RAFLS迁移和侵袭能力的增加。 结论：炎性条件可促进RAFLS表达CCR3及其趋化因子配体Eotaxin增加。Eotaxin可促进RAFLS表达CCR3、 MMP2及MMP9mRNA增加,并提高RAFLS的迁移和侵袭能力。这些作用可被CCR3阻断剂SB328437所抑制。Eotaxin通过与其趋化因子受体CCR3的相互作用,促进RAFLS迁移到软骨、进入软骨和骨的交界处、刺激其释放基质金属蛋白酶MMP2和MMP9降解软骨等组织,最终形成骨破坏,在RA的软骨破坏和骨侵蚀等病理进展中发挥了重要的作用。