沙美特罗丙酸氟替卡松对慢性阻塞性肺疾病的治疗作用与抗炎机制的研究

背景 慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种气流受限不完全可逆的疾病。FEV1通常用来评估COPD疾病的严重程度。COPD病情逐渐进展，与长期吸入有害气体及颗粒，导致肺内持续性的异常炎症有关[1,2]。吸烟是主要危险因素[3]。尽管停止吸烟能延缓COPD的进展，但疾病的炎症反应仍持续，且不完全可逆[4-6]。 最近的报道提示获得性免疫反应参与了COPD的病理生理过程[7]。这能更好的解释COPD患者停止吸烟后肺内炎症仍持续的原因。在此过程中，CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞扮演了重要的角色[8]。Treg细胞数量的减少可削弱对自身抗原的耐受[9]。同时，获得性免疫反应相关的细胞因子及炎症介质积极的参与了COPD的发病过程。更好的理解获得性免疫反应及T细胞的作用能更好的理解COPD疾病过程，减轻气道炎症，干预疾病病程。目前，多种治疗方法能减轻COPD患者的症状，提高生活质量，但均不能控制炎症，终止疾病进展[10]。吸入长效支气管舒张剂可改善COPD患者症状，提高肺功能及生活质量。吸入糖皮质激素可减少症状频繁的恶化，减少COPD急性加重次数。联合吸入支气管舒张剂沙美特罗与糖皮质激素氟替卡松比单用某一药物疗效更好[11-13]。已有研究显示沙美特罗丙酸氟替卡松（SFC）对COPD具有一定的抗炎作用[14]，从而改善临床症状。然而SFC是否通过作用于Foxp3+Treg细胞而发挥临床疗效尚不清。 在本研究中，我们假设SFC可通过增加COPD患者外周血Foxp3+Treg的比例，增强免疫耐受，减少诱导痰细胞总数及中性粒细胞数，降低炎症因子如：IL-8、TNF-a以及IL-17A的水平，从而减轻炎症。 方法 1.人口资料募集2009年9月至2010年1月重庆新桥医院门诊稳定期COPD患者21例。研究方案通过第三军医大学第二附属医院本地伦理委员会。所有参加者均通过知情同意，所有的程序均符合赫尔辛基宣言及中国相关法规。研究方案在中国临床试验注册中心（成都）登记注册，注册号为ChiCTR-TNC-10001270. 2.研究设计本研究是一个自身前后对照的临床研究，所有受试者均接受SFC50/500ug（葛兰素史克公司生产）每日2次的吸入治疗12周，分别在-2、0、4、8及12周来院访视。研究期间允许使用茶碱及短效β2受体激动剂。 3.外周血收集及处理在0周与12周时用肝素抗凝管采集外周血。4ml用于分离淋巴细胞。余4ml离心1200g，10分钟后收集上清，存于-70°冰箱待测细胞因子浓度。 4.流式细胞分析计数采用密度梯度法分离全血中单个核细胞（PBMC）。通过流式细胞仪检测表达细胞表面标记CD4、CD25及核内标记Foxp3的T细胞。Calibur流式细胞仪选用488nm及633nm波长检测，通过Flowjo软件分析数据。 5.痰液诱导及处理所有受试者均采用超声雾化吸入3%高渗生理盐水后诱导痰液。痰液经0.1%二硫苏糖醇稀释后予以1500g,4°C离心10分钟，上清存于-70°冰箱待测细胞因子浓度。沉渣采用吉姆萨染色行细胞分类计数。[15，16] 6.酶联免疫法（ELISA）按照ELISA试剂盒说明书方法检测外周血及诱导痰上清中IL-8、TNF-a、IL-10与IL-17A浓度。 7.肺功能检测按照美国胸科协会指南，采用肺功能仪检测使用支气管舒张剂前后的FVC与FEV1。 8.六分钟步行试验及呼吸困难评分（MMRC） COPD患者按要求在长30米的平地上来回走动，持续6分钟，记录行走距离，过程中给予最大的鼓励。若病人呼吸急促导致不能继续行走时可停下休息。采用MMRC评分表对呼吸困难进行分级[17]。 结果 1.21例COPD受试者均有吸烟史，其中20例男性，1例女性。PostFEV1%27～65%。所有患者在研究期间未发生COPD的中重度加重，均完成研究； 2.经SFC治疗12周后，COPD患者舒张前FEV1（preFEV1）%较治疗前显著性升高； 3.从临床指标来看，经联合治疗后，呼吸困难评分值（MMRC）较治疗前显著性降低；治疗后6分钟步行试验距离较治疗前显著性增加； 4. SFC治疗12周后，诱导痰细胞总数、中性粒细胞数较治疗前均显著性减少；治疗后的中性粒细胞百分比较治疗前显著性降低； 5.从炎症指标来看，治疗后痰上清中炎症因子IL-8、TNF-α、IL-17A的水平较治疗前均显著性降低；治疗后血清中炎症因子IL-8、TNF-α、IL-17A的水平较治疗前亦显著性降低； 6.SFC治疗12周后，经流式细胞仪检测，COPD外周血中CD4+Treg细胞占CD4+T细胞的比例较治疗前显著性升高；但治疗后的CD4+Treg细胞占CD4+T细胞的比例仍显著低于健康人；同时我们还发现：COPD患者治疗前外周血中的IL-17A水平与Foxp3+Tregs细胞的比值呈负相关。 结论 SFC可降低COPD炎症因子的水平，改善临床症状；同时，COPD炎症因子的水平与Foxp3+Treg的比值密切相关。