雪莲菌菌相分析及抗癌活性研究

雪莲菌,又称西藏灵菇、藏灵菇,英文名Tibetan Kefir Grain,是一种对牛乳等有发酵作用的天然混菌体系。本文以采集自我国4个不同地区的雪莲菌样品为研究对象,研究了其菌相组成及抗癌活性。雪莲菌样品分别为：TK-ZJUJ01来源于拉萨,TK-ZJUJ02来源于成都,TK-ZJUJ03来源于乌鲁木齐,TK-ZJUJ04来源于西宁。 通过传统的菌种鉴定方法,分离纯化鉴定到了各个雪莲菌样品中的可培养微生物：TK-ZJUJO1中分离纯化得到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),乳酸乳球菌(Lactococcus lactis),马克斯克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus),以及酿酒酵母菌(Saccharomyce cerevisiae); TK-ZJUJ02中分离纯化得到开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefiri), kudriavzevii毕赤酵母菌(Pichia kudriavzevii),马克斯克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus),单孢酿酒酵母菌(Kazachstania unispora); TK-ZJUJ03中分离纯化得到乳明串珠菌(Leuconostoc lactis),乳酸乳球菌(Lactococus lactis),植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),单孢酿酒酵母菌(Kazachstania unispora),马克斯克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus), exigua酿酒酵母菌(Kazachstania exigua);TK-ZJUJ04中分离纯化得到植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum), fabarum醋酸菌(Acetobacter fabarum),单孢酿酒酵母菌(Kazachstania unispora),李也蒙毕赤酵母菌(Pichia guilliermondii)。其中Pichia kudriavzevii和Pichia guilliermondii两种酵母菌是第一次在雪莲菌中发现。 通过宏基因组学高通量测序的方法对4个雪莲菌样品进行了细菌组成多样性分析,得到了更全面的细菌组成结果。在4个雪莲菌样品中,共鉴定到11个属：乳球菌属(Lactococcus),乳杆菌属(Lactobacillus),醋酸菌属(Acetobacter),明串珠菌属(Leuconostoc)和链球菌属(Streptococcus),希瓦氏菌属(Shewanella),不动杆菌属(Acinetobacter),(Pelomonas)属,(Dysgonomonas)属,魏斯氏菌属(Weissella)和假单胞菌属(Pseudomonas),其中后6个属是第一次在雪莲菌中发现。α-多样性及β-多样性分析表明,不同来源的雪莲菌其细菌菌相组成虽然不同,但多样性程度相近,雪莲菌中的菌相在“种”的水平上组成各有不同,但在“属”的水平上组成稳定。主成分分析(PCA)分析表明,对雪莲菌的菌相组成多样性贡献最大的三个属分别为乳杆菌属(Lactobacillus),乳球菌属(Lactococcus)和醋酸菌属(Acetobacter)。 通过对4个雪莲菌菌粒的复配培养得到了最优重组菌粒TK-ZJUJ06。菌相分析表明,重组菌粒菌相组成多样性程度降低,细菌组成中的优势菌相乳杆菌属(Lactobacillus),乳球菌属(Lactococcus)及醋酸菌属(Acetobacter)等组成稳定而风险菌相比例下降；而酵母菌经分离纯化只鉴定到酿酒酵母(Saccharomyce cerevisiae)。发酵性能测定表明,TK-ZJUJ06发酵性能及挥发性物质产生稳定,将TK-ZJUJ06作为进一步研究对象。 噻唑蓝实验(MTT)、流式细胞仪(FCM)及实时荧光定量(RT-PCR)分析表明,雪莲菌TK-ZJUJ06发酵乳Cell-free fraction对人胃癌细胞SGC7901的增殖具有抑制作用,并在一定范围内呈剂量依赖关系,当作用浓度为8mg mL-1时,癌细胞存活率为22%,抑制作用显著。进一步的机制探讨表明,雪莲菌TK-ZJUJ06发酵乳Cell-free fraction能够阻遏人胃癌细胞SGC7901由G1期向S期的过渡,并通过上调box基因(从3.30±0.19上调至14.25±0.31)和下调bcl-2基因(从9.50±0.23下调至4.72±0.11)的表达量而诱导SGC7901细胞发生早期(50.41%)及晚期凋亡(9.89%)。 响应面实验设计(RSM)优化了雪莲菌粒TK-ZJUJ06的增殖培养条件。最优培养条件为脱脂乳浓度41.6%,培养温度30.05℃,接种量1.86%,培养时间20h。在此条件下,雪莲菌粒的平均生长速率为14.33%,与初始培养条件下的生长速率(10.28%)相比,提高了39.4%。保存条件比较结果表明,冷冻干燥或热干燥后,雪莲菌中的菌种存活率均在60%以上,两种方法都适用于雪莲菌的整粒保存。