缺血性中风也称脑梗死,是由于脑动脉管腔在短期内出现狭窄或闭塞,导致所供应的脑组织发生缺血缺氧性变性或死亡,出现相应的神经功能受损的疾病。包括短暂性脑缺血发作、脑血栓形成以及脑栓塞。其主要发病对象为60岁以上人群,已成为严重威胁中老年人健康的主要疾病。缺血性中风的发病机制主要涉及炎症因子损害、细胞内钙超载、自由基损伤、细胞凋亡、兴奋性氨基酸损伤等。黄芩苷是黄芩的主要药理成分,是黄酮类化合物,具有良好的抗氧化能力。虽然已有学者研究了黄芩苷治疗缺血性中风的抗氧化机制,但主要是停留在观察黄芩苷对内源性抗氧化酶的活性影响及脂质过氧化产物清除方面,没有做更深一步的研究。本论文旨在通过动物、细胞、体外化学实验三个层次去深入探讨黄芩苷对脑缺血的保护作用及抗氧化机制。
1目的
从动物实验、细胞实验、体外化学实验三个方面探讨黄芩苷对脑缺血治疗的抗氧化作用机制,并确定黄芩苷对脑缺血的治疗时间窗。
2方法
2.1黄芩苷对大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)大鼠模型的治疗时间窗研究
健康雄性SD大鼠60只随机分为6组：假手术组、模型组、黄芩苷0h给药组、黄芩苷2h给药组、黄芩苷4h给药组、黄芩苷6h给药组,每组10只。建立大鼠线栓法大脑中动脉栓塞模型,通过神经功能评分和脑梗死体积来确定治疗时间窗。
2.2黄芩苷对MCAO小鼠模型氧化应激的干预
健康雄性C57BL/6小鼠60只,随机分为3组：假手术组、模型组、黄芩苷给药组,每组20只。其中每组中有10只测超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malondialdehyde, MDA),5只测活性氧(reactive oxygen species, ROS)荧光,5只测烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸氧化酶(nicotinamide adeninedinucleotide phosphate oxidase, NADPH oxidase)活性。建立小鼠线栓法大脑中动脉栓塞模型,采用二氢溴化乙啶(dihydroethidium, DHE)标记冰冻切片氧化应激ROS红色荧光法及SOD、MDA比色法,以及检测NADPH氧化酶活性,探讨黄芩苷对MCAO小鼠氧化应激的干预作用。
2.3黄芩苷对大鼠原代皮层神经元过氧化损伤的保护作用研究
取SD大鼠的乳鼠皮层神经元进行原代培养,采用300μmol/L双氧水造成神经元过氧化损伤模型,给予黄芩苷干预,检测对细胞存活率、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)漏出量及细胞上清液SOD活性的影响。
2.4黄芩苷清除自由基和对自由基生成的干预作用
取不同浓度的黄芩苷溶液,采用1,1-二苯基苦基苯胼(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl, DPPH)法测定黄芩苷自由基清除能力,用试剂盒测定黄芩苷抗超氧阴离子和总抗氧化能力,通过检测尿酸生成来测定黄芩苷对黄嘌呤氧化酶活性的影响。
3结果
3.1黄芩苷对MCAO大鼠模型的治疗时间窗研究
与模型组比较,黄芩苷0h、2h、4h组均能改善MCAO大鼠神经功能评分和脑梗死体积(P<0.01,P<0.01,P<0.05),6h组有改善神经功能评分和脑梗死体积的趋势,但是与模型组比较没有统计学意义(P>0.05)。
3.2黄芩苷对MCAO小鼠氧化应激的干预
黄芩苷能显著抑制MACO小鼠脑匀浆中MDA生成(P<0.01),并显著增强SOD活性(P<0.01)；在DHE标记冰冻切片氧化应激活性氧(ROS)红色荧光检测中,黄芩苷能显著减少ROS的荧光表达(P<0.01)；黄芩苷能明显抑制脑缺血后NADPH氧化酶活性(P<0.05)。
3.3黄芩苷对大鼠原代皮层神经元过氧化损伤的保护作用研究
黄芩苷能显著增加神经元过氧化氢损伤细胞存活率,显著抑制细胞培养液中LDH漏出量(P<0.05,P<0.01),显著增强SOD活性(P<0.01)
3.4黄芩苷清除自由基和对自由基生成的干预作用
黄芩苷对DPPH自由基和超氧阴离子有较好的清除能力；对黄嘌呤氧化酶有抑制作用,黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤氧化生成尿酸的含量随黄芩苷浓度升高而降低；黄芩苷具有显著的总抗氧化能力,且呈现明显的量效关系。
4结论
在动物实验中,黄芩苷对MCAO大鼠显示了良好的脑保护作用,其治疗时间窗可达4h。黄芩苷脑保护作用与抗氧化有关,其可减少ROS的荧光表达,减少MDA生成,抑制NADPH氧化酶活性并上调SOD活性。
在细胞氧化应激模型中,黄芩苷能对神经元氧化应激损伤发挥保护作用,进一步表明了黄芩苷对氧化应激的对抗作用。
在化学实验中,证实了黄芩苷能直接清除自由基,抑制黄嘌呤氧化酶活性,减少超氧阴离子生成,有良好的总抗氧化能力。
