吗啡对大鼠海马神经元肌动蛋白重构的影响及机制研究

目的：树突棘形态变化与兴奋性突触活性有关，并主要依赖于骨架肌动蛋白的重构。研究证明骨架肌动蛋白在树突棘的形成、消失、稳定性、大小和形态中发挥了关键作用。肌动蛋白可发生可逆性聚合（形成F-actin）和解聚（形成G-actin）的动态变化，该可逆过程称为肌动蛋白动力学。调节肌动蛋白动力学过程不仅影响树突棘形态而且伴随着突触效能的改变，特异性的肌动蛋白调节机制是树突棘可塑性及学习、记忆的基础。最近研究显示，杏仁核肌动蛋白重构是大鼠吗啡戒断伴随的厌恶性记忆形成的关键，提示肌动蛋白重构可能在吗啡成瘾形成中发挥重要作用，但是吗啡诱导神经元树突棘肌动蛋白重构的调控机制目前尚未阐明。本研究拟从影响神经元树突棘形态和功能的骨架肌动蛋白入手，探讨吗啡诱导肌动蛋白重构的动力学过程；以cofilin的磷酸化及脱磷酸化状态为切入点，探讨Calcineurin/SSH-1L信号通路在吗啡诱导的肌动蛋白重构中的作用，进一步深化阿片类药物成瘾的细胞及分子生物学机制。 方法： 1海马神经元的原代培养： 取新生乳大鼠，断头、取脑，置于冰浴的DMEM-高糖溶液中，分离海马，加入到适当的木瓜酶（2mg/ml）中，37℃，消化30分钟，种植液用加血清的DMEM液冲洗2次后，用进口的1ml枪头吹打，海马基本可以全部分散成细胞悬液，然后用种植培养液将细胞浓度调至7×105/ml。将细胞悬液种入预先铺好的多聚赖氨酸的6孔或24孔培养板中，6-8小时后换成Neurobasal+B27的无血清培养液。以后每3天换一次液，等培养第11天进行药物处理。 2免疫细胞化学染色： 培养第9-10天，提取细胞爬片标本，PBS洗3次，浸入4%多聚甲醛溶液中固定30min,后用0.1%TritonX-100透化处理5min，3%牛血清封闭30min，然后在盖玻片上滴加抗大鼠NeuN抗体(1:100稀释)4℃过夜，PBS漂洗3次，滴加生物素标记二抗工作液在37℃孵育1h。PBS重复洗3次，滴加HRP标记的链霉卵白素复合物工作液，37℃孵育30min，PBS再次漂洗，DAB显色，苏木精复染，盐酸-酒精分色，系列酒精脱水，二甲苯透明，然后中性树胶封固。在光镜下观察，每视野计数100个细胞，最后对NeuN免疫染色阳性细胞所占的百分比进行统计。 3Western-blot检测蛋白水平： 收集细胞，根据G-actin为胞浆可溶性蛋白，F-actin为细胞骨架相关蛋白，采用不同裂解液对这两种蛋白进行分步提取，分别检测其中drebrin、cortactin的表达变化。收集细胞，提取总蛋白，BCA试剂盒进行蛋白定量，Western blot方法检测吗啡处理不同时间以及阻断剂处理大鼠海马神经元肌动蛋白及其结合蛋白表达变化。 结果： 1大鼠海马神经元的形态学观察结果 光镜下观察到海马神经元于接种后1～2小时开始贴壁，细胞呈圆形或者椭圆形，3天后，细胞从胞体长出数个突起，7～10天开始成熟，胞体逐渐长至40μm，光晕明显，细胞核和核仁清晰可见，突起变得更粗、更长并且相互交错形成网络。免疫细胞化学染色鉴定纯度可达93%。 2吗啡处理不同时间对海马神经元F-actin/G-actin比值的影响 与对照组相比，吗啡处理1h、24h和72h海马神经元F-actin/G-actin的比值分别下调25%（P<0.01），32%（P<0.001）和15%（P<0.001），表明在吗啡处理不同时间肌动蛋白发生了重构。 3吗啡处理不同时间对drebrin的影响 3.1总蛋白中drebrin的变化 与对照组相比，吗啡处理1h、24h和72h海马神经元总蛋白中drebrin的水平分别下调25%（P<0.05），41%（P<0.001）和43%（P<0.001）。 3.2与F-actin结合的drebrin的变化 与对照组相比，吗啡处理1h海马神经元中与F-actin结合的drebrin的水平无显著变化；吗啡处理24h和72h与F-actin结合的drebrin的水平分别下调57%（P<0.001）和74%（P<0.001），说明drebrin与F-actin的结合性发生了变化。 3.3drebrin在肌动蛋白骨架和胞浆的比率的变化 与对照组相比，吗啡处理1h、24h和72h海马神经元drebrin在肌动蛋白骨架和胞浆的比率分别下调为25%（P<0.001），74%（P<0.001）和67%（P<0.001）。说明drebrin发生了移位和部分脱落。 4吗啡处理不同时间对cortactin的影响 4.1总蛋白中cortactin的变化 与对照组相比，吗啡处理1h、24h和72h海马神经元总蛋白中cortactin的水平无显著变化。 4.2与F-actin结合的cortactin的变化 与对照组相比，吗啡处理1h海马神经元中与F-actin结合的cortactin的水平无显著变化；吗啡处理24h和72h与F-actin结合的cortactin的水平分别下调25%（P<0.05）和46%（P<0.001）。说明cortactin与F-actin的结合性也发生了变化。 4.3cortactin在肌动蛋白骨架和胞浆的比率的变化 与对照组相比，吗啡处理1h海马神经元cortactin在肌动蛋白骨架和胞浆的比率无显著差异；吗啡处理24h和72h海马神经元cortactin在肌动蛋白骨架和胞浆的比率下调71%（P<0.001）和52%（P<0.001）。说明cortactin也发生了移位和脱落。 5吗啡处理不同时间对海马神经元cofilin/p-cofilin水平的影响 与对照组相比，吗啡处理1h、24h和72h海马神经元总蛋白中cofilin的水平无显著变化。与对照组相比，吗啡处理1h和24h海马神经元总蛋白中p-cofilin的水平分别下调48%（P<0.01）和70%（P<0.001）；吗啡处理72h海马神经元总蛋白中p-cofilin的水平无显著变化。 6吗啡处理不同时间对海马神经元LIMK/P-LIMK、SSH-1L水平的影响 6.1总蛋白中LIMK的变化 与对照组相比，吗啡处理1h海马神经元LIMK水平无显著变化，而吗啡处理24h LIMK水平明显上调30%（P<0.001）。 6.2总蛋白中P-LIMK的变化 与对照组相比，吗啡处理1h和24h P-LIMK水平均无显著变化。 6.3总蛋白中SSH-1L的变化 与对照组相比，吗啡处理1h海马神经元SSH-1L水平无显著变化，而吗啡处理24h海马神经元SSH-1L水平明显上调64%（P<0.01）。 7拮抗剂MK801对吗啡诱导的海马神经元肌动蛋白重构的影响 7.1MK801对海马神经元F-actin/G-actin比值的影响 与对照组相比，吗啡处理组F-actin/G-actin比值明显下调32%（P<0.001）；与吗啡组相比, MK801组F-actin/G-actin比值明显上调45%（P<0.01）。 7.2MK801对海马神经元drebrin的影响 与对照组相比，吗啡处理组总蛋白中drebrin水平下调41%（P<0.001）；与F-actin结合的drebrin水平下调56%（P<0.001）；drebrin在肌动蛋白骨架和胞浆的比率下调74%（P<0.001）。与吗啡组相比，MK801组总蛋白中drebrin水平上调24%（P<0.01）；与F-actin结合的drebrin水平上调41%（P<0.001）；drebrin在肌动蛋白骨架和胞浆的比率上调65%（P<0.001）。 7.3MK801对海马神经元cortactin的影响 对照组、吗啡组、MK801组海马神经元总蛋白中cortactin的水平无显著变化。与对照组相比，吗啡组与F-actin结合的cortactin的水平下调25%（P<0.05）；cortactin在肌动蛋白骨架和胞浆的比率下调71%（P<0.001）。与吗啡组相比，MK801组与F-actin结合的cortactin的水平无显著变化，但cortactin在肌动蛋白骨架和胞浆的比率上调62%（P<0.001）。 7.4MK801对海马神经元cofilin/p-cofilin水平的影响 对照组、吗啡组、MK801组这三组海马神经元总蛋白中cofilin水平无显著性变化。与对照组相比，吗啡组p-cofilin水平下调70%（P<0.001）；与吗啡组相比，MK801组p-cofilin上调87%（P<0.001）。 7.5MK801对海马神经元SSH-1L水平的影响 与对照组相比，吗啡组海马神经元SSH-1L水平上调64%（P<0.01）；与吗啡组相比，MK801组海马神经元SSH-1L水平下调30%（P<0.05）。 8拮抗剂FK506对吗啡诱导的海马神经元肌动蛋白重构的影响 8.1FK506对海马神经元F-actin/G-actin比值的影响 与对照组相比，吗啡组F-actin/G-actin比值明显下调32%（P<0.001），与吗啡组相比, FK506组F-actin/G-actin比值明显上调57%（P<0.01）。 8.2FK506对海马神经元drebrin的影响 与对照组相比，吗啡组海马神经元总蛋白中drebrin水平下调41%（P<0.001）；与F-actin结合的drebrin水平下调56%（P<0.001）; drebrin在肌动蛋白骨架和胞浆的比率下调74%（P<0.001）。与吗啡组相比，FK506组总蛋白中drebrin水平无显著性变化；与F-actin结合的drebrin水平上调33%（P<0.01）；drebrin在肌动蛋白骨架和胞浆的比率明显上调60%（P<0.001）。 8.3FK506对海马神经元cortactin的影响 对照组、吗啡组、FK506组这三组海马神经元总蛋白中cortactin的水平无显著变化。与对照组相比，吗啡组与F-actin结合的cortactin的水平下调25%（P<0.05）；cortactin在肌动蛋白骨架和胞浆的比率下调71%（P<0.001）。与吗啡组相比，FK506组与F-actin结合的cortactin水平无显著性变化；cortactin在肌动蛋白骨架和胞浆的比率上调63%（P<0.001）。 8.4FK506对海马神经元cofilin/p-cofilin水平的影响 对照组、吗啡组、FK506组这三组海马神经元总蛋白中cofilin水平无显著性变化。与对照组相比，吗啡组p-cofilin水平下调70%（P<0.001）；与吗啡组相比，FK506组p-cofilin海马神经元明显上调64%（P<0.001）。 8.5FK506对海马神经元SSH-1L水平的影响 与对照组相比，吗啡组海马神经元SSH-1L水平上调64%（P<0.01）；与吗啡组相比，FK506组海马神经元SSH-1L水平下调50%（P<0.05）。 结论： 1吗啡处理不同时间诱导了大鼠海马神经元肌动蛋白重构。 2吗啡处理不仅影响了肌动蛋白结合蛋白drebrin，cortactin的含量，还影响了与F-actin的结合性。 3吗啡处理影响了cofilin的磷酸化过程。 4吗啡可能通过calcineurin/SSH-1L通路影响了cofilin的磷酸化状态，降低了肌动蛋白结合蛋白drebrin、cortactin与F-actin的结合性，进而导致了神经元树突棘肌动蛋白重构，使树突棘稳定性下降。