1.SHED外泌体miR-100-5p抑制mTOR缓解颞下颌关节骨关节炎 2.疼痛中心性量表在疼痛颞下颌关节紊乱病中的应用

颞下颌关节紊乱综合征(Temporomandibular disorder,TMD)是一种高发病率的疾病,主要临床特点为慢性的疼痛,是一类疾病的总称。在整个TMD患者中,颞下颌关节骨关节炎(Temporomandibular joint osteoarthritis,TMJ-OA)是引起颞下颌关节疼痛和功能障碍的主要原因。OA主要病理变化是持续性的炎症状况,软骨细胞是OA发生病理变化的主要介导者之一。OA严重影响了人群的生活质量,然而,目前的治疗手段都比较有限。近年来,基于间充质干细胞疗法方法的发展,为OA的治疗提供了新的策略。研究表明,间充质干细胞及其来源的外泌体能够促进关节组织修复和控制炎症。在外泌体携带的生物分子中,微小非编码RNA(miRNA)可以调控基因表达,因此受到关注。外泌体具有精准且高效的作用机制,并且其易于保存,因而Exosomes-miRNA的靶向治疗技术具有极高的转化应用前景。研究发现,人脱落乳牙牙髓干细胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth,SHED)在抑制脑损伤、肾损伤等炎症反应中发挥了重要作用,而外泌体与其来源细胞具有相似的生物学功能。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)是高度保守丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,软骨的生长发育以及OA的发生、治疗等过程均与m TOR介导的信号通路密切相关,同时,m TOR也是一种自噬重要的负调节因子。抑制m TOR的表达,则可以激活软骨细胞的自噬,抑制氧化应激和炎症反应,从而达到治疗OA的目的。由于SHED的易获取,具有高度增殖能力,基于SHED-Exo(stem cells from human exfoliated deciduous teeth-originated exosomes)可能具有抑制炎症反应、促进组织修复等生物学潜能,结合OA炎性微环境的病理状态,我们推测,SHED-Exo是否可以通过诱导软骨细胞迁移、增殖,调节炎症反应等作用,对OA的炎症状态起到治疗作用。本研究中,我们主要关注SHED-Exo中的特异性miRNA成分,是否可以通过外泌体的转运作用进入软骨细胞,抑制软骨细胞中的m TOR的表达,从而抑制软骨细胞的炎症反应,治疗OA。研究目的本研究为体外细胞实验,研究人脱落乳牙牙髓干细胞来源外泌体是否能够促进人软骨细胞的迁移及增殖,外泌体中的miR-100-5p,是否可以通过外泌体的转运作用进入软骨细胞,抑制软骨细胞中的m TOR的表达,从而抑制软骨细胞的炎症反应。研究方法1.从儿童脱落乳牙牙髓中提取乳牙牙髓干细胞,使用流式细胞仪、成骨和成脂分化对其进行鉴定。同时从髁突骨折患者的髁突中提取髁突软骨细胞,并进行I,II型胶原免疫荧光的检测,从而鉴定软骨细胞。用超速离心法提取乳牙牙髓干细胞外泌体,使用WB的方法对外泌体表面标记CD9、CD63、TSG101进行检测,通过透射电子显微镜进行外泌体的形貌分析,NTA进行粒径检测。2.将SHED-Exo经PKH67染色,示踪定位外泌体进入软骨细胞的情况,通过划痕实验和CCK8细胞增殖实验检测SHED-Exo对软骨细胞迁移和增殖的影响。本实验应用IL-1β构建软骨细胞OA炎症状态的细胞模型,通过检测OA相关炎症因子的表达情况评价SHED-Exo抑制软骨细胞炎症反应的能力。3.SHED-Exo中的miRNA的表达情况通过高通量测序技术和数据的生物信息分析进行检测和分析,结合miRNA在外泌体中的表达丰度及生物信息学分析结果,根据实验设计筛选与OA相关的目标miRNA(miR-100-5p),并对其是否可以转运进入软骨细胞和在抑制炎症反应方面(通过miR-100-5pmimics和inhibitors进行验证)发挥的作用进行研究。4.通过数据分析,对miR-100-5p的靶基因进行预测和筛选,最终选取m TOR作为候选基因,进行miR-100-5p抑制IL-1β诱导的髁突软骨细胞炎症的反应的机制研究。进行荧光素酶报告基因活性检测,WB实验以及通过在软骨细胞中加入m TOR的抑制剂RAPA,探讨沉默m TOR对软骨细胞炎症反应的影响,从多个角度检测miR-100-5p与m TOR 3’UTR的结合作用。研究结果1.本研究提取的SHED阳性表达CD146,CD73,不表达CD34,具有成脂、成骨的分化潜能,符合SHED特征。提取的软骨细胞形态为广泛接触的多角形,I,II型胶原表达阳性,符合髁突软骨细胞特征。使用超速离心法提取乳牙牙髓干细胞外泌体,WB结果显示外泌体阳性表达CD9、CD63、TSG101,透射电子显微镜显示外泌体为双层囊膜状结构的小囊泡,呈典型的茶托型。NTA粒径检测结果证明外泌体粒径均一,峰值(135nm)和粒径(50～150nm)范围为均符合外泌体特征。2.SHED-Exo经PKH67染色后示踪,显示其可以通过內吞进入软骨细胞。划痕实验和CCK8增殖结果显示,与SHED-CM及空白对照组相比,SHED-Exo能明显促进细胞的迁移和增殖。使用IL-1β组构建体外颞下颌关节骨关节炎细胞模型,q RT-PCR和WB结果显示,与对照组相比较,SHED-Exo能够明显降低的OA相关炎性因子的表达(P<0.05)。3.通过高通量测序对SHED-Exo中的所有miRNA进行了筛查,根据miRNA在SHED-Exo中的相对含量进行了排序,并对SHED-Exo中含量位于前二十的miRNA的靶基因进行了KEGG分析,得到其靶基因相关的疾病和信号转导通路的分布和显著性情况。经过生物信息学分析和结合表达丰度,本研究选择了miR-100-5p作为目标miRNA,进一步研究SHED-Exo对髁突软骨细胞炎症反应的作用。q RT-PCR表明SHED-Exo可以介导其自身携带的miR-100-5p进入软骨细胞。本实验将miR-100-5p mimics和inhibitors转染至软骨细胞后观察OA相关炎症因子的表达情况,从而判断其生物学功能。结果显示过表达miR-100-5p明显降低了软骨细胞中MMP1、MMP9、MMP13的表达水平,而沉默miR-100-5p则升高了软骨细胞中MMPs的表达水平,说明miR-100-5p对IL-1β诱导的软骨细胞的炎症反应具有抑制作用。4.对miR-100-5p的靶基因进行预测和筛选,最终选取m TOR作为候选基因,进行miR-100-5p对髁突软骨细胞炎症反应作用的机制研究。双荧光素酶报告基因实验表明miR-100-5p与m TOR具有靶向结合性。WB实验结果表明过表达miR-100-5p及加入SHED-Exo可明显的抑制m TOR在蛋白水平的表达,而抑制miR-100-5p表达可以使m TOR表达显著升高。在软骨细胞中加入m TOR的抑制剂Rapamycin,IL-1β诱导的髁突软骨细胞炎症反应的相关因子表达水平显著性降低。说明m TOR可以抑制IL-1β诱导的髁突软骨细胞炎症反应。进而证明了miR-100-5p通过靶向结合m TOR-3’UTR,抑制了髁突软骨细胞的炎症反应。结论SHED-Exo中的miR-100-5p可以通过外泌体的转运作用进入软骨细胞,通过抑制m TOR的表达进而降低IL-1β诱导的髁突关节软骨细胞炎症反应。结合SHED-Exo可以促进软骨细胞迁移和增殖,可以认为,乳牙牙髓干细胞来源的外泌体,具有治疗OA的潜能。SHED易获得,具有高度增殖能力,加之外泌体的稳定性、易保存性和低免疫原性,使SHED-Exo应用于TMJ-OA的治疗领域具有广阔的前景。目的:汉化疼痛中心性量表(COPS),将其应用于疼痛颞下颌关节紊乱病(TMD)患者,并对其进行信度、效度进行检验,探索该量表在国内进行疾病疼痛评估的临床应用适用性。方法:共收集166例疼痛性TMD患者完成COPS汉化版(COPS-C),除COPS-C外,还要求患者填写疼痛灾难化量表(PCS)和疼痛自我效能问卷(PSEQ)。使用内部一致性信度和重测信度评估COPS-C的可靠性,使用探索性因子分析(EFA)评估COPS-C的构建有效性,通过分析COPS-C得分与PCS和PSEQ得分之间的相关性来确定收敛效度。结果:总COPS-C评分的Cronbach'sα值为0.942。条目间相关系数介于0.356至0.901之间。COPS-C的ICC值介于0.815-0.929之间。EFA的结果表明该测量的单因素解决方案,占观察到的总方差的70.4%。所有项目的因子载荷范围从0.713到0.917。探索性因素分析结果显示,量表具有单因子的维度结构,累积方差贡献率达到70.4%。收敛效度表明COPS-C与PCS和PSEQ具有中等相关性。结论:表明COPS-C应用于疼痛TMD患者具有可靠性和有效性,该量表适用于疼痛研究,为疼痛TMD治疗的临床研究和评价TMD治疗效果提供新的方法。