目的：
探讨肾虚痹证(类风湿性关节炎)病证结合动物模型的制作方法,为研究中医药治疗肾虚痹证(类风湿性关节炎)的作用及其机理提供实验工具,并以期为病证结合动物模型的制作提供进一步的科学依据。
方法：
本课题分为两部分实验来进行研究：
实验一：选用6周龄SPF级SD大鼠80只、Wistar大鼠80只、Lewis大鼠40只,雌雄各半。采用尾根部皮下注射Ⅱ型胶原与不完全弗氏佐剂混合物的方法诱导出关节炎模型,对不同品系、不同性别大鼠在胶原诱导性关节炎(Collagen-induced arthritis, CIA)模型中的发病情况进行比较研究。
实验二：选用6周龄SPF级SD大鼠100只,雌雄各半,除对照组大鼠外,分别切除大鼠的双侧睾丸和卵巢,制作肾虚动物模型。分别在去势1周、2周、3周、4周后,采用尾根部皮下注射Ⅱ型胶原与不完全弗氏佐剂混合物的方法诱导出关节炎模型,从而对不同去势时间(即不同肾虚状态)下,CIA发病情况进行比较研究,并采用ELISA等方法对其机理进行初步探讨。
结果：
实验一：
对三种不同品系大鼠发病情况数据进行动态分析,发现不同种属发病率不同,χ2=72.94,P<0.0001；时间与发病率相关,χ2=15.39,P=0.0005,有显著性差异,随着免疫时间的延长,发病率越高。两两比较显示,SD和Wistar大鼠与Lewis大鼠发病率有显著性差异(P均<0.0001),但SD与Wistar无显著性差异(P=0.6183)。
重复测量方差分析结果显示：(1)不同品系大鼠AI不同,有显著性差异(P<0.0001)；组间两两比较结果显示：Lewis比SD、wistar大鼠AI低,有显著性差异(P<0.0001),且SD比wistar大鼠AI高,差异亦具有显著性(P=0.045)。(2)性别对AI没有影响(P=0.737)。免疫28d内各时段与其他时间相比均有显著性差异(P<0.0001),28d后各时段比无显著性差异(P均>0.05)。
显著性检验考虑性别和属种两因素对病理积分的影响,采用双因素方差分析统计,总体方差分析结果显示性别对病理积分影响无显著性(P>0.05),种属对病理积分影响有显著性差异(P<0.05)。两两比较采用LSD法检验,结果显示,Lewis比SD、Wistar大鼠关节病理积分低,有显著性差异(P<0.05),而SD与Wistar大鼠之间无显著性差异。
实验二:
对不同去势时间关节炎发病情况数据进行动态分析,发现对照CIA组大鼠与CIA去势组大鼠,或者不同去势时间CIA大鼠发病率影响没有显著性差异(P=0.9159)。
重复测量方差分析结果显示：(1)性别对AI没有影响(P=0.667)；(2)与对照CIA组相比,与去势4周组AI明显升高(P=0.006),与去势1周相比,亦有显著性差异(P=0.014),其余各组之间相比均无显著性差异。
考虑性别和去势时间两因素对病理积分的影响,采用双因素方差分析统计,结果显示性别对病理积分影响无显著性(P>0.05),去势时间对病理积分影响有显著性差异(P<0.05)。
双因素方差分析统计结果显示性别对CORT影响有显著性(P<0.0001),数据显示性别和分组之间有交互作用(P<0.05),所以按性别做分层分析可以了解不同性别分组之间的差异。结果显示,去势后,不同性别大鼠对CORT的反应变化相反,即与未去势CIA组比较,雌性去势CIA组大鼠血浆CORT水平明显降低(P<0.01,P<0.05),除去势1周组外,雄性大鼠CORT均显著升高(P＜0.01,P<0.05),且与去势时间呈正相关,大鼠去势3周血浆CORT与去势4周相比,无显著性差异。
双因素方差分析统计显示性别对抗Ⅱ型胶原抗体影响无显著性(P=0.384),去势时间对抗Ⅱ型胶原抗体影响有显著性差异(P<0.0001),LSD法两两比较显示,随着去势时间增加,抗Ⅱ型胶原抗体明显升高,与对照CIA组比较,去势2、3、4周CIA组大鼠血清抗Ⅱ型胶原抗体水平明显升高(P<0.05),去势1、2、3、4周CIA组大鼠血清抗Ⅱ型胶原抗体水平有显著性差异(P<0.05)。
双因素方差分析统计结果显示性别对IL-6影响有显著性(P=0.0034),数据显示性别和分组之间无交互作用(P=0.3356),去势时间对IL-6影响有显著性差异(P<0.0001),两两比较采用LSD法检验,结果显示,与对照CIA组比较,去势2周、3周、4周CIA组大鼠IL-6水平明显升高(P<0.05),去势1周、2周、3周、4周CIA组大鼠血清IL-6水平亦有显著性差异(P<0.05),随着去势时间增加,明显升高。
双因素方差分析结果显示性别对IL-10影响有显著性(P<0.0001),数据显示性别和分组之间无交互作用(P=0.3356),去势时间对IL-10影响有显著性差异(P<0.0001),两两比较采用LSD法检验,结果显示,各组CIA组大鼠血浆IL-10水平随着去势时间增加,明显升高,均有显著性差异(P<0.05)。
结论：
(1)对于Ⅱ型胶原免疫诱导的大鼠关节炎模型,Wistar和SD大鼠发病率和发病程度均明显高于Lewis大鼠。Wistar和SD大鼠发病率无显著性差异,但发病程度SD大鼠明显高于Wistar大鼠。三种品系大鼠雌雄之间发病率和发病程度无明显差异。因此,在制作痹证(类风湿性关节炎)大鼠模型时,建议首选SD大鼠,其次可以选择Wistar大鼠,雌雄均可。
(2)肾虚在CIA发病过程中起着重要作用,随着去势时间的延长,即肾虚程度加重,CIA有效发病率和发病程度亦随之增加；在去势4周后其有效发病率就可达到95%,且发病程度明显高于同期未去势大鼠。因此,在制作肾虚痹证(类风湿性关节炎)病证结合动物模型时,在大鼠去势4周时就可用CⅡ进行免疫诱导。
(3)根据以上实验结果,并结合前期工作基础,肾虚痹证(类风湿性关节炎)病证结合大鼠模型的具体制作方法如下：选用SD大鼠,鼠龄6周龄,SPF级,雌雄均可。按常规方法切除大鼠的双侧睾丸或卵巢。于去势后4周,取适量Ⅱ型胶原溶液(浓度为2mg/ml)逐滴加入至等容积的不完全弗氏佐剂中,Ⅱ型胶原终浓度为1mg/ml。冰浴中用匀浆器充分乳化,以滴加水中不扩散为度,取乳化后的混合物按0.2ml/只,即200μgCⅡ/只,于尾根部皮下注射。7d后按0.1ml/只,即100μg CⅡ/只,于尾根部皮下加强免疫一次。
