生、炒酸枣仁相伍抗抑郁作用机制及相伍后化学成分变化研究

目的：明确生、炒酸枣仁(1：1)相伍的抗抑郁作用及单胺能系统作用机制。阐明生、炒酸枣仁相伍后化学成分变化。 方法： 1.生、炒酸枣仁相伍抗抑郁作用研究 1.1生、炒酸枣仁相伍对行为绝望模型的作用 将ICR小鼠随机分为5组,每组10只,分别为模型组、氟西汀组、生枣仁组、炒枣仁组和相伍组。各给药组灌胃给予相应药物,模型组给予同体积蒸馏水。于末次给药后1h,进行小鼠游泳应激实验和小鼠悬尾应激实验,记录小鼠6min内后4min的累计不动时间。 1.2生、炒酸枣仁相伍对氟西汀的抗抑郁协同作用 将ICR小鼠随机分为6组,每组10只,分别为模型组、氟西汀组、生枣仁联合组、炒枣仁联合组、相伍联合组。各给药组灌胃给予相应药物,模型组给予同体积蒸馏水。于末次给药后1h,进行小鼠游泳应激实验和小鼠悬尾应激实验,记录小鼠6min内后4min的累计不动时间。 1.3生、炒酸枣仁相伍抗抑郁作用的量效关系与时效关系研究 将ICR小鼠随机分为5个给药剂量组(2.5g/kg,5g/kg,10g/kg,20g/kg,40g/kg),灌胃途径给药,于末次给药后1h,进行小鼠游泳应激实验,记录小鼠6min内后4min的累计不动时间。 将ICR小鼠随机分为5个给药天数组(5天,7天,9天,11天,14天),灌胃途径给药,于末次给药后1h,进行小鼠游泳应激实验,观察6min,记录小鼠6min内后4min的累计不动时间。1.4生、炒酸枣仁相伍对小鼠慢性应激抑郁模型的作用 将ICR小鼠随机分为4组,每组10只,分别为空白组、模型组、氟西汀组和相伍组。除空白组外,其余各组采用孤养结合慢性轻度不可预见性刺激的方法,进行连续21天的刺激,复制小鼠慢性应激抑郁模型,从造模第11天开始,各给药组于每次刺激前1h灌胃给予相应药物,模型组和空白组灌胃给予同体积蒸馏水,连续11天。末次刺激结束后,记录各组小鼠体质量变化,糖水消耗百分比和旷场行为学参数。 1.5生、炒酸枣仁相伍对小鼠利血平拮抗模型的作用 将ICR小鼠随机分为3组,每组10只,分别为模型组、丙咪嗪组和相伍组。各给药组灌胃给予相应药物,模型组给予同体积蒸馏水,连续11天。于末次给药1h后,腹腔注射利血平(2.5mg/kg)。观察小鼠体温下降、睁眼不能和运动不能情况,记录体温下降值、睁眼不能的百分率和运动不能的百分率。 1.6生、炒酸枣仁相伍对5-HTP引起的小鼠甩头模型的作用 将ICR小鼠随机分为3组,每组10只,分别为模型组、氟西汀组和相伍组。各给药组灌胃给予相应药物,模型组给予同体积蒸馏水,连续11天。于末次给药1h后,腹腔注射5-HTP(300mg/kg),观察小鼠甩头行为,记录15min内的甩头次数。1.7生、炒酸枣仁相伍对小鼠育亨宾毒性增强模型的作用将ICR小鼠随机分为3组,每组10只,分别为模型组、丙咪嗪组和相伍组。各给药组灌胃给予相应药物,模型组给予同体积蒸馏水,连续11天。于末次给药1h后,皮下注射育亨宾(30mg/kg),空白组皮下注射同体积生理盐水,观察记录各组24h内死亡只数,计算死亡百分率。2.生、炒酸枣仁相伍抗抑郁作用机制研究2.1生、炒酸枣仁相伍对慢性应激抑郁模型小鼠海马和额叶皮质5-HT含量及生物代谢的影响 将ICR小鼠随机分为4组,每组10只,分别为空白组、模型组、氟西汀组和相伍组。除空白组外,其余各组采用孤养结合慢性轻度不可预见性刺激的方法,进行连续21天的刺激,复制小鼠慢性应激抑郁模型,从造模第11天开始,各给药组于每次刺激前1h灌胃给予相应药物,模型组和空白组灌胃给予同体积蒸馏水,连续11天,末次刺激结束后,断头取脑,分离海马和额叶皮质,ELISA法检测5-HT、5-HTIAA和TPH含量,并推算5-HTIAA/5-HT比值。 2.2生、炒酸枣仁相伍对慢性应激抑郁模型小鼠海马5-HT转运体编码基 因(S1c6a4)和5-HTlA受体编码基因(Htrla)表达的影响 将ICR小鼠随机分为4组,每组10只,分别为空白组、模型组、氟西汀组和相伍组。除空白组外,其余各组采用孤养结合慢性轻度不可预见性刺激的方法,进行连续21天的刺激,复制小鼠慢性应激抑郁模型,从造模第11天开始,各给药组于每次刺激前1h灌胃给予相应药物,模型组和空白组灌胃给予同体积蒸馏水,连续11天,末次刺激结束后,断头取脑,冰上迅速分离海马,随机选择5个样本,采用荧光定量PCR技术,检测海马部位Slc6a4和Htrla的基因表达量。2.3生、炒酸枣仁相伍对慢性应激抑郁模型小鼠海马和额叶皮质DA含量及生物代谢的影响 将ICR小鼠随机分为4组,每组10只,分别为空白组、模型组、氟西汀组和相伍组。除空白组外,其余各组采用孤养结合慢性轻度不可预见性刺激的方法,进行连续21天的刺激,复制小鼠慢性应激抑郁模型,从造模第11天开始,各给药组于每次刺激前1h灌胃给予相应药物,模型组和空白组灌胃给予同体积蒸馏水,连续11天,末次刺激结束后,断头取脑,分离海马和额叶皮质,ELISA法检测DA、HVA和TH含量,并推算HVA/DA比值。2.4生、炒酸枣仁相伍对慢性应激抑郁模型小鼠海马DA转运体编码基因(Slc6a3)表达的影响 将ICR小鼠随机分为4组,每组10只,分别为空白组、模型组、氟西汀组和相伍组。除空白组外,其余各组采用孤养结合慢性轻度不可预见性刺激的方法,进行连续21天的刺激,复制小鼠慢性应激抑郁模型,造模第11天起,各给药组于每次刺激前1h灌胃给予相应药物,模型组和空白组灌胃给予同体积蒸馏水,末次刺激结束后,断头取脑,冰上迅速分离海马,随机选择5个样本,采用荧光定量PCR技术,检测小鼠海马部位Slc6a3基因表达量。3.生、炒酸枣仁相伍后化学成分变化 比较生酸枣仁水煎提取物(简称生品水煎物)、炒酸枣仁水煎提取物(简称炒品水煎物)、生、炒酸枣仁合煎提取物(简称合煎物)的HPLC-ELSD指纹图谱,分析生、炒酸枣仁相伍后化学成分变化；采用HPLC-ELSD法同时检测生品水煎物、炒品水煎物、合煎物中三种成分斯皮诺素、酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B的含量,分析生、炒酸枣仁相伍后抗抑郁有效成分含量变化 结果： 1.生、炒酸枣仁相伍对行为绝望模型的作用 与模型组相比,相伍组和氟西汀组小鼠游泳不动时间显著缩短(P<0.01),作用优于生枣仁组(P<0.05)。相伍组和氟西汀组小鼠悬尾不动时间显著缩短(P<0.01),作用优于生枣仁组(P<0.05)。 2.生、炒酸枣仁相伍对氟西汀的抗抑郁协同作用 与氟西汀组相比,相伍联合组小鼠游泳不动时间和悬尾不动时间显著缩短(P<0.05),表现出对氟西汀的抗抑郁协同作用。生枣仁联合组和炒枣仁联合组小鼠游泳不动时间和悬尾不动时间没有显著缩短(P<0.05),未表现出对氟西汀的抗抑郁协同作用。 3.生、炒酸枣仁相伍抗抑郁作用的量效关系与时效关系 在2.5g/kg-10g/kg剂量范围内,生、炒酸枣仁相伍抗抑郁作用存在剂量剂量依赖性,超出此范围,抗抑郁作用不再继续加强,10g/kg抗抑郁作用最佳。 在5-11天给药天数范围内,生、炒酸枣仁相伍抗抑郁作用存在时间依赖性,超出此范围,抗抑郁作用不再增加。连续给药11天抗抑郁作用最佳。 4.生、炒酸枣仁相伍对小鼠利血平拮抗模型的作用 生、炒酸枣仁相伍能对抗利血平拮抗模型的抑郁症状,表现为注射利血平2h后体温下降显著减少(P<0.01)；运动不能的百分率显著降低(P<0.05,P<0.01)。 5.生、炒酸枣仁相伍对5-HTP引起的甩头模型的作用 生、炒酸枣仁相伍能增加5-HTP引起的小鼠甩头次数,表现腹腔注射5-HTP后15min内甩头次数显著提高(P<0.05)。 6.生、炒酸枣仁相伍对小鼠育亨宾毒性增强模型的的作用 生、炒酸枣仁相伍不能增强育亨宾的毒性反应,表现为小鼠24h内死亡百分率未见显著提高(P>0.05)。 7.生、炒酸枣仁相伍对小鼠慢性应激抑郁模型的作用 生、炒酸枣仁相伍能改善慢性应激抑郁模型的抑郁症状,表现为显著提高慢性应激抑郁小鼠体质量增长速度(P<0.01)；显著提高糖水消耗百分比(P<0.05)；显著增加小鼠穿格数、直立次数、理毛次数(P<0.01,P<0.05),减少排便次数(P<0.05)。 8.生、炒酸枣仁相伍对慢性应激抑郁模型小鼠海马和额叶皮质部位5-HT含量及生物代谢的影响 生、炒酸枣仁相伍能显著增加慢性应激抑郁小鼠海马和皮质部位的5-HT含量(P<0.05),显著增加海马部位5-HIAA含量(P<0.01),提高海马部位5-HIAA/5-HT比值(P<0.05)。 9.生、炒酸枣仁相伍对慢性应激抑郁模型小鼠海马5-HT转运体编码基因(Slc6a4)和5-HTlA受体编码基因(Htrla)表达量的影响 生、炒酸枣仁相伍能够下调慢性应激抑郁小鼠海马部位Slc6a4基因表达,上调海马部位Htr1a基因表达。 10.生、炒酸枣仁相伍对慢性应激抑郁模型小鼠海马和额叶皮质部位DA含量及生物代谢的影响 生、炒酸枣仁相伍能显著增加慢性应激抑郁小鼠海马部位DA含量(P<0.05)。 11.生、炒酸枣仁相伍对慢性应激抑郁模型小鼠海马DA转运体编码基因(Slc6a3)的影响 生、炒酸枣仁相伍能够下调慢性应激抑郁小鼠海马部位Slc6a3基因表达。 12.生、炒酸枣仁相伍后化学成分变化 通过对比合煎物、生品水煎物和炒品水煎物的HPLC-ELSD指纹图谱,三种水煎物的峰数量一致,合煎物中未发现新成分。 合煎物中一些峰的峰面积百分比发生变化,表明生、炒酸枣仁相伍后一些成分比例发生变化。 13.生、炒酸枣仁相伍后斯皮诺素、酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B含量变化 合煎物斯皮诺素含量为3.7898mg,酸枣仁皂苷A含量为2.2849mg,在三种水煎物中含量最高；酸枣仁皂苷B含量为1.1823mg,居于生品水煎物和炒品水煎物之间。 结论： 1.生、炒酸枣仁相伍抗抑郁作用显著,优于生、炒酸枣仁单用。 2.生、酸枣仁相伍抗抑郁作用机制为：抑制突触间隙5-HT的重摄取,增加突触后膜5-HT1A受体,提高中枢5-HT能系统的功能和兴奋性；抑制突触间隙DA的重摄取,提高中枢部分脑区DA含量。 3.生、炒酸枣仁相伍后没有化学成分没有显著变化,一些成分比例产生较大变化。斯皮诺素含量和酸枣仁皂苷A含量增加。