细菌氨肽酶的产酶条件优化及应用研究

蛋白质水解可产生肽类物质和少量氨基酸,明显改善了其溶解性、热稳定性以及营养特性,但其水解液往往会呈现苦味,应用受到了极大的限制。氨肽酶可从氨端切除苦味肽上的疏水氨基酸,从而达到脱苦的目的。本论文主要研究了氨肽酶的产酶发酵条件、酶学性质以及其在大豆分离蛋白中的应用。 优化后的最佳发酵条件为:玉米淀粉40 g/L,豆渣30 g/L,K2HPO4 3.216 g/L,KH2PO4 0.074 g/L,MgSO4?7H2O 0.3 g/L,NaCl 1g/L,CoCl2 1mL(0.1mol/L),培养时间24h,pH值7.5,接种量8%,装液量20mL/250mL,温度40oC,转速200r/min。优化后的发酵液酶活为2685.6U/mL,比原配方发酵液酶活提高了1.71倍,在7L发酵罐上扩大培养,酶活达到1200 U/mL。 粗酶液经20%～40%乙醇分级沉淀,回收率为50.3%。研究表明,酶的半衰期为22天,最适反应温度为55℃,最适pH为8.5,温度稳定范围20～70℃,pH稳定范围在8.0～10.0左右。甘油、蛋白胨对酶活的影响不大,但在含有明胶等化合物的溶液中,酶活损失较严重; Zn2+、Ni2+对酶活有较强的抑制作用,Co2+对酶活有较强的激活作用;Pepstatin有轻微抑制,EDTA有强烈抑制作用,而Co2+可解除EDTA的抑制作用;枯草芽孢杆菌Zj016氨肽酶活性中心可能结合了两个Zn2+,每个亚基一个;米氏常数Km为0.53mmol/L,最大反应速度Vmax为19.23μmol/L/min。 应用研究表明,氨肽酶与碱性蛋白酶对大豆分离蛋白协同水解的最佳水解条件为:温度50℃、pH8.5、两酶与底物浓度比均为10000U/g、底物浓度60g/L,水解时间4h,水解度达25.0%。对碱性蛋白酶单酶与双酶的水解产物研究结果对比表明:双酶水解产物的苦味明显低于单酶水解产物,几乎不呈现苦味;两种酶解产物的分离峰峰型、分子量分布及比例有较大的差异,两酶协同水解产物的疏水值均低于单酶水解产物的;两酶协同水解产物游离氨基酸含量为1610mg/L,碱性蛋白酶单酶水解产物游离氨基酸含量为1250mg/L。