芒柄花黄素对宫颈癌细胞增殖的影响及其机制研究

背景：宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤，是威胁女性生命的第二大恶性疾病，近年来有逐渐年轻化的趋势，已经成为重大的社会问题。全世界每年约45～50万新发病例，死亡20万例，其中约80％集中在发展中国家。我国是宫颈癌的高发病率国家之一，每年新增宫颈癌病例约13.5万，占全球发病数量的1/3，每年有8万妇女死于此病。宫颈癌最常用的治疗手段是手术和放疗，综合治疗是宫颈癌治疗的新趋势，化疗联合放疗、化疗联合手术、放疗联合手术等形式治疗越来越多的用于临床。国内外许多学者试图通过放射治疗设备和放疗技术的不断改进，以及联合化疗来提高治疗效果，但是仍未能解决子宫颈癌治疗失败的主要原因：肿瘤原发病灶未能获得及时有效控制以及恶性肿瘤细胞远处器官转移。放射治疗不能控制原发肿瘤的原因有：肿瘤细胞固有放射敏感性差，肿瘤细胞在分割放疗的1～2个月中残存细胞的加速再增殖；肿瘤组织中存在不同比例的乏氧细胞，具有辐射抗性；宫颈周围存在的正常组织如直肠，小肠，膀胱等耐受量低，限制了放疗剂量的提高；放射治疗是一种局部治疗手段，对于潜在的远处转移癌没有治疗作用。随着宫颈癌发病年轻化及患者对治疗后生活质量要求的提高，寻找高效低毒药物是提高化疗成功率和患者生存率、改善患者生活质量的关键。黄芪(Astragalus mongholicus Bunge)系豆科类黄芪属植物，为重要传统的益气药。现代药理学研究表明，黄芪具有多种生物活性，黄芪提取物及其主要成分的免疫调节作用、心血管调节作用以及抗癌的研究已取得很大进展。文献研究发现黄芪中含有多种化学成分，从而导致了其生物活性的多样性。黄芪皂苷I具有早期糖尿病治疗的作用，黄芪皂苷Ⅳ具有抗炎作用、缺血性脑损伤保护作用，黄芪皂甙及多糖具有心血管保护作用和免疫调节作用。黄芪中的总黄酮因其具有的抗氧化功能，也被用于抗突变、抗衰老等方面的研究。作为黄芪活性成分之一，芒柄花黄素可以抑制多种癌细胞增殖，促进其凋亡，比如乳腺癌，前列腺癌等，但在宫颈癌中的研究尚未报道。 目的：本研究选用宫颈癌Hela细胞株为研究对象，探讨黄芪活性成分芒柄花黄素对宫颈癌细胞株的抑制作用；进一步制备裸鼠成瘤模型，在动物水平探讨芒柄花黄素对小鼠宫颈癌的抑制作用。 方法：在宫颈癌Hela细胞株的培养基中加入不同浓度的芒柄花黄素：采用MTT法检测芒柄花黄素对细胞增殖的抑制作用，采用流式细胞术和Hoechst/PI染色法检测芒柄花黄素对细胞凋亡的影响；检测细胞内ATP含量的变化。制备裸鼠成瘤模型，检测不同浓度的芒柄花黄素对肿瘤生长的抑制作用。分子水平上，采用免疫印迹方法检测细胞内bax、bcl-2、caspase-3以及P13K/Akt的改变。 结果： 1）MTT实验结果显示，在药物浓度为1μmol/L时，药物对细胞增殖没有显著影响，但从5μmol/L开始，芒柄花黄素呈现剂量依赖的抑制肿瘤细胞增殖的作用。 2）流式结果显示，在药物浓度为1μmom/l时，药物对细胞凋亡率没有显著影响，当药物剂量增加到5μmom/l时，芒柄花黄素能够显著促进肿瘤细胞的凋亡，并且呈现剂量依赖性。我们进一步采用Hoechst/PI对细胞进行染色，采用不同浓度的芒柄花黄素处理细胞（5μmol/L,10μmol/L,25μmol/L）。结果显示，芒柄花黄素处理宫颈癌细胞能够显著促进细胞的凋亡。 3)我们用不同浓度的芒柄花黄素（1μmol/L,5μmol/L,10μmol/L,25μmol/L）作用于宫颈癌Hela细胞，检测细胞内ATP的含量。结果显示，从药物浓度为5μmol/L开始，细胞内ATP含量发生明显降低。随着药物剂量的增加，Hela细胞内的ATP水平逐渐降低，有一定的剂量依赖性。接下来我们检测不同浓度芒柄花黄素对细胞氧消耗量的影响（5μmol/L,10μmol/L,25μmol/L），作用不同时间后（1min,2min,5min,15min），细胞内氧气消耗量逐渐下降，呈现时间和剂量梯度依赖性。 4）所有裸鼠在实验过程中均成活并伴有肿瘤生成，采用不同浓度的芒柄花黄素（10mg/kg和20mg/kg）处理成瘤小鼠，可以显著减轻肿瘤的重量和体积。 5)我们用不同浓度的芒柄花黄素（1μmol/L,5μmol/L,10μmol/L）作用于宫颈癌Hela细胞，采用免疫印迹方法检测细胞内bax蛋白的含量。结果显示，从药物浓度为5μmol/L开始，细胞内bax蛋白表达量明显提高。 6)我们用不同浓度的芒柄花黄素（1μmol/L,5μmol/L,10μmol/L）作用于宫颈癌Hela细胞，采用免疫印迹方法检测细胞内bcl-2蛋白的含量。结果显示，芒柄花黄素刺激细胞24h后，细胞内bcl-2蛋白表达量显著降低。 7）采用不同浓度的芒柄花黄素（1μmol/L,5μmol/L,10μmol/L）作用于宫颈癌Hela细胞，24h后检测凋亡蛋白caspase-3表达量的变化。结果显示，芒柄花黄素可以显著促进caspase-3的表达。 8）我们进一步检测芒柄花黄素对细胞信号通路P13K/Akt的改变。采用不同浓度的芒柄花黄素（1μmol/L,5μmol/L,10μmol/L）作用于宫颈癌Hela细胞，24h后检测P13K/Akt表达量的变化。结果显示，芒柄花黄素可以显著抑制AKT的磷酸化水平。 结论：本文研究发现芒柄花黄素可以明显抑制宫颈癌细胞增殖，促进细胞凋亡。裸鼠成瘤实验同样表明芒柄花黄素可以降低肿瘤细胞的生长速率。进一步我们发现，芒柄花黄素作用于宫颈癌Hela细胞后，促进bax和caspase蛋白表达降低bcl-2表达，抑制P13K/Akt信号通路。通过这些结果的阐释，初步探讨了芒柄花黄素对抗宫颈癌细胞生长和增殖的抑制作用及分子机制，从而为该类肿瘤干预靶点的发现和筛选提供了坚实的基础，具有重要的科学意义和社会意义。