附子和乌头是我国临床常用的重要中药。本品不仅在日本、韩国等亚洲国家广泛使用,而且在西方国家也有悠久的药用历史。附子的功能是:回阳救逆、补火助阳、散寒除湿、温中止痛。临床主要用于阳气衰微、阴寒内盛、四肢厥冷、脉微欲绝之亡阳脱证;肾阳不足所致的腰膝疼痛、形寒肢冷、阳痿遗精、尿频数;脾阳不振所致的脘腹冷痛、大便溏泄之证。乌头主要用于风寒湿痹、周身关节疼痛属于寒湿偏胜者。乌头类生物碱既是乌头和附子的主要有效成分,又是主要毒性成分。乌头碱主要毒性作用的靶器官为神经系统和心脏系统。乌头碱的神经、心脏及肌肉毒性主要是由于其使电压依赖型Na+通道向超级去极化的方向位移,从而导致Na+通道的永久激活。乌头碱的心脏毒性主要表现为恶性心律失常,其心脏毒性（主要是心律失常）的细胞分子机制研究仍未完善,尤其是从心肌细胞兴奋-收缩偶联系统的钙信号转导及其调控角度探讨其导致心律失常的机制尚未有人提出,并且此系统中钙调控蛋白的功能及相互作用也是当今心律失常分子机制研究的热点方向。所以本课题从此方向入手,深入揭示乌头碱致心律失常的细胞分子机制和心律失常发生的细胞分子机制,有一定的前瞻性和较强的创新性。
本论文的主要研究内容和结果如下:
1乌头碱对原代培养的大鼠乳鼠心肌细胞的毒性效应
1.1乌头碱对心肌细胞形态的影响
加入不同浓度0.5μM、1μM及3μM的乌头碱作用1 hr后,心肌细胞形态均发生了不同程度的变化。加药后心肌细胞出现了伪足收缩（细胞膜收缩）,空泡（胞浆中形成较明显的包含小体）,颗粒（出现黑色的颗粒状物质）等形态学变化。通过分级评价统计结果发现乌头碱对心肌细胞形态的影响呈现出一定的时间依赖性和剂量依赖性关系。
1.2乌头碱对心肌细胞自发搏动频率的影响
不同剂量的乌头碱对心肌细胞的自发搏动频率产生不同程度的影响。低浓度乌头碱（0.1 ~ 0.5μM）导致心肌细胞自发搏动的频率降低,但并不显著。结果说明较小剂量的乌头碱作用于心肌细胞可以通过细胞自身代谢消除药物对其自发搏动的影响。而较高浓度的乌头碱（1μM和3μM）对心肌细胞的自发搏动频率影响较大,加入1μM乌头碱后,在5 min内细胞搏动频率暂时升高,细胞出现类似抽搐状态,约15 min后细胞搏动频率逐渐下降,直至搏动停止。而3μM乌头碱对心肌细胞自发搏动的影响更大,抽搐状态更加明显,而后细胞搏动频率降低的也更为显著。
1.3乌头碱对心肌细胞活力的影响
乌头碱可导致心肌细胞活力显著降低,3μM乌头碱作用60 min后,心肌细胞的活力仅为对照组的40%左右。而1μM乌头碱作用60 min后,心肌细胞活力的下降并没有3μM乌头碱的影响显著。从结果中还以可看出,乌头碱作用30 min,60 min和120 min后,各组心肌细胞的活力有一定的差异。由此可见,乌头碱可导致心肌细胞活力的下降呈现出明显的剂量依赖性关系和一定的时间依赖性关系。
1.4乌头碱对心肌细胞膜通透性的影响
乌头碱可导致心肌细胞胞浆中的LDH的释放,即乌头碱可引起心肌细胞膜通透性的改变,由此引起心肌细胞的损伤。与乌头碱对心肌细胞活力影响的变化规律基本一致,乌头碱对细胞膜通透性的影响也呈现一定的剂量依赖性和时间依赖性关系。
1.5乌头碱对心肌细胞DNA损伤的影响
由彗星实验可以看出,对照组DNA呈现圆形的荧光团,说明DNA基本无损伤。而加药组DNA呈现出不同程度的彗星图像,说明乌头碱造成了心肌细胞DNA不同程度的损伤。随着乌头碱浓度的增大,大部分心肌细胞均出现彗尾现象,并且彗尾长度增大,彗尾荧光强度增强。使用Comet ScoreTM Freeware对各组细胞电泳图进行分析,结果表明不同浓度的乌头碱作用后,DNA彗星图中头部直径都没有明显变化,而1μM和3μM乌头碱作用后细胞的DNA彗星长度和彗尾长度都明显升高,尾部DNA含量也显著增大,0.5μM乌头碱的作用不如1μM和3μM变化显著。由此可见,乌头碱可导致心肌细胞DNA的损伤,并且乌头碱的浓度越大,DNA损伤程度越严重。
2乌头碱对原代培养的大鼠乳鼠心肌细胞钙调控的影响
2.1乌头碱对心肌细胞内钙信号的影响由钙波图可以看出,乌头碱作用后,心肌细胞内钙振荡的振幅明显减小,并且高浓度乌头碱（3μM）较低浓度乌头碱（0.5μM）导致心肌细胞钙振荡振幅的变化更加明显。由此可见乌头碱对心肌细胞内钙信号产生了影响,破坏了钙稳态的平衡,导致钙振荡的幅度发生很大变化,而这可能是影响心肌细胞收缩–舒张功能的主要依据。图中还可看出,心肌细胞内相对的游离的钙含量([Ca2+]i)随着乌头碱浓度的增加而增加。0.5μM乌头碱作用后,钙波图中显示基线未出现明显的向上漂移现象,表明心肌细胞内相对钙含量没有明显改变。而3μM乌头碱作用后,钙波基线明显向上漂移,表明心肌细胞内相对钙含量显著增加。
2.2离子通道阻断剂和乌头碱对心肌细胞的相互作用
1μM乌头碱作用后,心肌细胞的自发钙振荡出现显著变化,钙振荡的频率增大而振幅减小,细胞内相对的游离的钙含量也逐渐增加。而加入0.05μM肌浆网钙释放通道RyR2的抑制剂钌红（RR）,钙振荡的振幅及频率逐渐恢复正常,并且钙波基线未出现明显的向上漂移现象,表明心肌细胞内钙稳态逐渐恢复正常。图中还可以看出,1μM乌头碱作用后,再加入1μM Na+通道的抑制剂河豚毒素（TTX）,钙振荡的振幅及频率逐渐恢复正常,并且钙波基线也未出现明显的向上漂移现象,表明心肌细胞内钙稳态也逐渐恢复正常。
2.3乌头碱对心肌细胞钙调控蛋白基因转录水平的影响
采用RT-PCR实验,检测乌头碱对心肌细胞内主要钙调控蛋白的基因转录水平,并使用Quantity OneV4.4 software进行灰度分析比较发现,1μM和3μM乌头碱作用60 min后,RyR2和NCX蛋白的基因转录水平均显著上升,并且呈现出一定的剂量依赖性关系。但是DHPR,CASQ2,SERCA2和PLB的基因转录水平没有显著变化。
2.4乌头碱对心肌细胞钙调控蛋白水平的影响
同时采用Western-Blot实验检测乌头碱对心肌细胞内主要钙调控蛋白的蛋白表达量的影响。同样使用Quantity OneV4.4 software进行灰度分析比较发现,0.5μM,1μM和3μM乌头碱作用后,RyR和NCX的蛋白表达量都有明显上调,并且呈现一定的剂量依赖性关系。而SERCA2和CASQ的蛋白表达量无显著变化。
3乌头碱对原代培养的大鼠乳鼠RyR2基因沉默的心肌细胞钙调控的影响
3.1乌头碱对RyR2基因沉默的心肌细胞中RyR2表达的影响结果显示,在心肌细胞中用FITC标记的二抗的荧光在对照组心肌细胞的胞浆中较为明显。在转染siRNA3 48 hrs后的心肌细胞中,视野内几乎所有的细胞都没有荧光,也证明了siRNA转染的成功。从结果中我们还可以看出,在RyR2沉默的心肌细胞中,乌头碱作用后,RyR2基因水平、蛋白表达及免疫荧光强度都显著升高,这也和我们先前的实验结果相一致,就是在正常的心肌细胞和RyR2基因沉默的心肌细胞中,乌头碱都能增加RyR2的表达。
3.2乌头碱可使RyR2基因沉默的心肌细胞内钙振荡部分恢复正常而不改变细胞内相对的钙含量
在正常的心肌细胞中我们可以观察到稳定而有周期性的自发的钙振荡。应用了浓度为3μM的乌头碱后,钙振荡的频率显著增加（约2倍左右）而钙振荡的振幅却明显下降,细胞内相对钙含量也显著增加。相反的,在RyR2基因沉默的细胞中,稳定而有周期性的自发钙振荡几乎消失了。加入3μM的乌头碱之后,细胞内钙振荡部分恢复正常,而细胞内相对的游离的钙含量保持在较低的水平,说明乌头碱可使RyR2基因沉默的心肌细胞内钙振荡部分恢复正常而不改变细胞内相对的钙含量。
3.3在RyR2基因沉默的心肌细胞中,乌头碱可提高咖啡因诱导的肌浆网钙释放的含量
肌浆网中钙释放含量的测定可采用传统的咖啡因灌注的方法。结果表明,在RyR2基因沉默的心肌细胞中,咖啡因刺激下钙瞬变的振幅较正常心肌细胞明显减小。当用含有3μM乌头碱的灌注液作用后,在正常心肌细胞和RyR2基因沉默的心肌细胞中,咖啡因诱导的钙瞬变的振幅均明显增加,表明乌头碱作用下肌浆网钙释放的含量明显增加。
3.4在RyR2基因沉默的心肌细胞中,乌头碱可抑制L-型Ca2+通道电流
电压–电流关系图（I-V曲线图）显示,正常心肌细胞的细胞外液中运用3μM的乌头碱可以使L-型Ca2+通道电流向正极方向移动。同样地,在RyR2基因沉默的心肌细胞中,加入乌头碱后L-型Ca2+通道电流也向正极方向移动。比较10 mV电压时电流的峰值,我们发现在RyR2基因沉默的心肌细胞中L-型Ca2+通道电流较在正常心肌细胞中的电流大。结果还表明在正常心肌细胞中,应用3μM的乌头碱可使L-型Ca2+通道电流抑制。同样的,在RyR2基因沉默的心肌细胞中,加入3μM的乌头碱也可使L-型Ca2+通道电流减小。
通过实验研究,我们可以得出了以下结论:
1.乌头碱可引起心肌细胞形态、活力、细胞膜通透性的变化。
2.乌头碱可引起心肌细胞DNA的损伤。
3.乌头碱可引起细胞内钙含量的超载,进而引起钙振荡的失调,从而最终引起心肌细胞自发搏动的紊乱。
4.乌头碱可导致钙调控蛋白RyR2和NCX基因转录水平和蛋白水平的增加。
5.乌头碱诱导的钙信号的紊乱能够被RyR2的抑制剂钌红（RR）逆转。
6.乌头碱可上调RyR2基因沉默的心肌细胞中RyR2的基因水平和蛋白水平。
7.在RyR2基因沉默的心肌细胞中,乌头碱可使紊乱的钙信号在一定程度上恢复正常而不改变细胞内相对的钙含量。
8.在RyR2基因沉默的心肌细胞中,乌头碱可提高肌浆网钙释放含量的增加。
9.在RyR2基因沉默的心肌细胞中,乌头碱可抑制L-型Ca2+通道电流。
由此可见,乌头碱通过影响心肌细胞兴奋-收缩偶联系统中钙调控蛋白的表达而引起心肌细胞的钙稳态失衡。肌浆网钙释放通道蛋白（RyR2）功能的改变是乌头碱作用于心肌细胞的一个重要结果。乌头碱导致肌浆网钙释放通道中Ca2+的过度释放是乌头碱诱导的钙依赖型心律失常的一个重要机制,而肌浆网钙释放通道的抑制剂钌红在某种程度上可以逆转乌头碱引发的心律失常。
