鸡新城疫单克隆抗体制备及免疫胶体金诊断试纸条的研制

新城疫是由新城疫病毒引起的高度接触性、传染性疫病,发病急,感染率和死亡率高,曾给养禽业,特别是养鸡业造成了严重的经济损失。本研究利用柠檬酸钠还原氯金酸,形成胶体金颗粒,应用一定直径的胶体金颗粒标记新城疫抗体或者抗原,从而建立起以免疫层析为基础的胶体金标记的快速诊断方法。这一诊断方法可以用来诊断抗原,也可以用来诊断抗体。本试验一方面制备单克隆抗体,制作了快速准确测定抗原的胶体金试纸条,并保证试纸条的特异性;另一方面制作了半定量快速检测抗体的胶体金试纸条,并保证试纸条的敏感性。 本试验首先将增殖的NDV用差速离心和过SephacrylTM S-200葡聚糖分子筛层析的方法进行纯化,并测定其纯度,经鉴定纯化结果良好,为做多克隆抗体和单克隆抗体准备好了抗原。兔抗ND血清抗体(IgG)的提纯采用了辛酸-硫酸铵法,提纯的IgG的纯度鉴定采用聚丙烯酞胺凝胶电泳法。 免疫胶体金的制备是实验的重点。经过反复实验,制备了直径为20nm胶体金颗粒,确定了胶体金与抗原和抗体的最佳结合量为36μg/ml,最佳pH值为9.0和8.2,同时确定了在制备试纸条时,在检测线和对照线上蛋白的最佳喷洒浓度为0.6mg/ml和0.5mg/ml。 测定抗体的胶体金试纸条是用NDV标记,用兔抗NDV抗体IgG作为对照线,用NDV为检测线,当检测抗体高于4个滴度的时候,检测线将出现浅红色,随着抗体水平的增高,红色逐渐加深,同时对照线也出现红色。通过对检测血清稀释后,试纸条变为最低检测6个滴度,以便于在临床上评估新城疫的免疫效果。 单克隆抗体的制备采用常用的方法。本研究确定了间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株的最佳反应条件,以建立的该方法对融合后杂交瘤细胞进行检测筛选,经过初检、二检,共获得阳性杂交瘤细胞株10株。利用有限稀释法进行3次亚克隆后,最终获得单抗2株,分别命名为4E8和5E6。