水稻吸收和利用不同形态氮素的生理特征和相关基因的表达调控分析

水稻是中国乃至世界的主要粮食作物之一，而氮（N）是其生产的重要限制因子。水稻在淹水的条件下，以铵（NH4+）作为主要的N源，但由于其根系的泌氧作用产生的根际硝化作用导致有相当数量的N以硝态氮（NO3--N）的形式吸收。前人已有报道，NH4+和NO3-混合营养更有利于水稻的生长和N肥的利用。因此，深入认识水稻吸收和利用NH4+、NO3-的生理机制，特别是从分子水平鉴定和分析调控NH4+、NO3-吸收和利用相关基因的功能，将对水稻的生产和提高N肥利用率产生积极的作用。本论文以华东地区广泛种植的粳稻品种“武运粳7#”为供试品种，研究了N饥饿7天（d）后，恢复供应不同形态N源（NH4+、NO3-、NH4NO3）在0．5小时（h）到4d对水稻N的吸收和积累及N还原同化中关键酶的生理差异和相关基因的调控，同时利用基因芯片对水稻恢复供应不同形态N素4d后所调控表达的基因进行了分析。另外，以粳稻模式种“日本晴（Nipponbare）”为材料，将基因启动子与GUS报告基因融合，研究了水稻高亲和力NO3-转运系统的4个编码基因（OsNRT2；3、OsNRT2；4、OsNAR2；1和OsNAR2；2）的启动子的时空表达特异性，以进一步推测它们的功能。主要研究结果如下： 1)通过水培试验，研究了N饥饿7d后，恢复供应不同形态N源对水稻（“武运粳7#”）N的吸收和积累及N同化中关键酶活性的影响。结果表明，缺N刺激根系的生长，增加了根冠比，供应NH4+营养抑制根系的生长，降低根冠比。与单一NO3-营养相比，供应NH4+营养显著地增加地上部生物量和体内的N积累。与单一NH4+或NO3-营养相比，NH4NO3营养促进了水稻对N的吸收和转运，叶片和根系中全N及叶片中NH4+-N的含量以NH4NO3处理最高，而且增强了根系的谷氨酰胺合成酶和叶片中硝酸还原酶的活性，提高了水稻同化和利用N的能力。另外，与单一NH4+营养相比，供应单一NO3-或NH4NO3混合营养显著增加了根系活力，从而提高了根系吸收N的能力。 2)利用半定量RTPCR分析水稻根系的NH4+、NO3-吸收和还原同化相关基因在恢复供应不同形态N素的表达模式。水稻高亲和力铵转运蛋白编码基因AMT1家属中OsAMT1；1是组成型表达，基本上不受N供应形态和状态的影响；而在N饥饿胁迫下OsAMT1；2和OsAMT1；3的表达很弱，恢复供应2．5 mM的NH4+和1．25 mM NH4NO3分别增强了OsAMT1；2和OsAMT1；3的表达，NO3-营养对OsAMT1；2的表达有明显的抑制作用；单一供NH4+或短时间供NO3-（恢复供应N2h内）增强了OsAMT1；3表达。说明OsAMTls基因不仅受NH4+浓度的调控，而且也受NO3-或体內外NH4+和NO3-平衡的影响。水稻高亲和的硝酸盐转运蛋白编码基因OsNRT2；3，在N饥饿时有较高的表达，而在高N供应时无论是单一NH4+、单一NO3-还是NH4NO3营养均减弱其表达。在水稻N饥饿后供应NO3-营养（NO3-或NH4NO3）迅速诱导了硝酸还原酶编码基因OsNiRl的表达，其中供NH4NO3比供单一NO3-更能促使OsNiR1的强烈而稳定的表达。相反，在氮同化中起重要作用的谷氨酰胺合成酶（GS酶）编码基因OsGS1；1的表达几乎不受N供应形态和缺N胁迫的影响。 3)利用包含水稻21，495寡核苷酸cDNA芯片（代表大约22，000个基因），以NH4NO3营养的水稻根系和叶片样品为对照，分析和鉴定了恢复供应NH4+-N、NO3--N和继续缺N4d后所调控的水稻的基因。结果表明，不同N营养处理下，根系比叶片响应更敏感。相比较NH4 NO3营养，当恢复供应单一的NH4+、NO3-，在根系显著被调控达2倍以上的基因分别是445和324个，而地上部仅分别为32和58个。这些受调控的基因不仅包含了可能直接参与N的吸收和代谢途径的基因，而且与叶绿素代谢及碳的固定和代谢密切相关。通过对这些被显著调控的基因上游500bp的启动子区域中顺式调控元件分析，鉴定到可能分别与NH4+、NO3-特异诱导的上游调控基因相结合的顺式调控元件分别是6个和8个。其中ARECOREZMGAPC4的顺式调控元件是包含在几乎所有的NO3-特异性诱导表达基因的启动子区，生物信息学分析表明它可能是MYB类型转录因子的结合位点。另外，鉴定到受单一NH4+、单一NO3-或N饥饿胁迫显著（2倍以上）响应的水稻18个转录因子基因，其中在根系表达的有16个，而在地上部表达的仅有2个。 4)将编码水稻高亲和硝酸盐转运蛋白基因的启动子片段与GUS报告基因相融合，再转入到水稻模式种“日本晴”的中，通过检测GUS报告基因的表达，分析了OsNRT2；3、OsNRT2；4、OsNAR2；1和OsNAR2；2的时空表达特异性和它们可能的生理功能。OsNRT2；3在根的中柱和叶脉表达，其功能可能不是主要承担对外部介质中NO3-的吸收，而是负责在体內对NO3--N的长距离运输或再利用。OsNAR2；1在整个根系特别是根冠强烈表达，说明它可能不仅与NO3-的吸收和转运等关系密切，也可能包含在NO3-的信号转导途径中作为NO3-或其它N营养的信号接收者，调控着根系对营养的吸收。OsNRt2；4和OsNAR2；2在根系和叶片叶脉中均有微弱的表达，其功能有待进一步深入研究。