羧甲司坦对慢性被动吸烟大鼠气道细菌负荷的影响及相关机制的研究

目的 慢性阻塞性肺疾病(COPD)在病程进展中常伴有急性发作,加速肺功能的下降,增加经济负担和病死率。69.6%的急性发作与细菌感染有关。 宿主局部炎症反应与气道细菌负荷量的增加成正比。2002年Miravitlles提出了COPD急性细菌感染的“阈值理论”。他认为,出现急性发作的前提是气道内的细菌负荷必须达到某最小阈值。影响COPD急性发作细菌阈值水平的因素有内在因素(肺功能受损、重度吸烟、气道高反应性、气道黏液高分泌和防御机制受损)和外在因素(细菌种类、干燥低温环境、空气污染和稳定期和急性发作期处理不当)。粘液纤毛清除功能是气道的非特异性防御机制,可以通过粘液纤毛清除系统清除病原菌,减低气道的细菌负荷。 羧甲司坦是经典的粘痰溶解剂,最新的体外研究证实其具有抗炎抗氧化特性,它可以清除ROS；并可抑制NE引起的粘蛋白的产生和抑制鼻病毒感染；它可以减少细菌粘附率,其抗细菌粘附特性与粘蛋白相关性很强。我们前期的PEACE研究表明,中至重度COPD病人口服羧甲司坦或安慰剂一年,羧甲司坦组可有效减少急性发作的次数,但其确切的机制还不清楚。本研究在体首次探讨了羧甲司坦对慢性吸烟大鼠气道的细菌负荷的关系,并从MUC5AC粘附细菌和MCC清除细菌功能方面探讨了相关机制。本研究旨在为羧甲司坦的临床应用提供实验依据。 方法 1.COPD鼠模型的制备 SPF级雄性Wistar大鼠96只随机分为4组,每组24只。A组正常对照组：正常饲养12周；B组COPD组：慢性被动吸烟12周,自制被动吸烟玻璃熏箱(0.8×0.6×0.6m3),箱顶留有2×2cm2的通气孔,燃烧大前门牌香烟,由三通管导入烟雾。一次熏烟燃烧大前门香烟12支,烟雾浓度约5%,持续0.5小时,每日吸烟2次,上下午各一次,每周5天,连续12周。C组羧甲司坦预防组：除吸烟外,从第1周起,羧甲司坦500mg／kg于吸烟日熏烟前半小时灌胃；D组羧甲司坦治疗组：除吸烟外,从第6周起,羧甲司坦500mg／kg于吸烟日熏烟前半小时灌胃。 2.肺功能测定 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,将各组大鼠应用AniRes2005动物肺功能分析系统(北京贝兰博科技有限公司)检测0.3秒率。 3.肺组织切片和BALF液的留取 肺组织放入4%多聚甲醛中固定石蜡包埋切片用于组织化学和免疫组织化学检测。其余右肺组织置-80℃保存用于PCR和Wester-blot检测。 4.阿辛蓝-过碘酸雪夫染色(AB-PAS) 石蜡切片经常规脱蜡至水后行AB-PAS染色以评价粘液样物质的表达和杯状细胞增生。 5.免疫组织化学染色 SABC法Muc5ac免疫组化检测用于测定Muc5ac阳染细胞数和Muc5ac表达的多少。 6.实时荧光定量逆转录聚合酶链(RT-PCR)法 检测大鼠气道Muc5acmRNA表达。7.蛋白质印迹实验(Western Blot):检测大鼠气道Muc5ac蛋白的表达。 8.闪烁照相技术测定大鼠的粘液纤毛清除功能 测定口咽滴入99mTc-Sc清除过程,作为评价大鼠的粘液纤毛清除功能 9.大鼠肺部接种Hi后细菌负荷的测定 12周后各组大鼠气管内接种定量的流感嗜血杆菌混悬液,3h后无菌取BALF和肺,BALF液和肺组织匀浆后计数细菌菌落为细菌负荷。 结果 1.COPD鼠模型确立肺组织病理学检测示B组有一定数量的炎细胞浸润并伴有肺泡壁破裂肺泡融合,肺泡腔扩大,肺功能检测FEV0.3/FVC<70%,符合COPD诊断。C组和D组少许炎细胞浸润,仅有部分肺泡壁破裂融合、肺泡腔扩大,FEV0.3/FVC也有改善。 2.大鼠气道Muc5ac表达和杯状细胞化生 B组存在着粘液高分泌即Muc5ac表达上调和杯状细胞化生增加,P<0.05。 3.大鼠气道的细菌负荷 B组大鼠气道的细菌负荷较A组升高,C组和D组经羧甲司坦干预后细菌负荷降低,P<0.05。 4.粘液纤毛清除功能测定较对照A组相比,B组粘液纤毛清除系统功能的下降,C组和D组粘液纤毛清除系统功能改善,P<0.05。且C组的改善作用更为明显。 结论 1.被动熏烟12周复制出COPD鼠模型 2.羧甲司坦降低了慢性阻塞性肺疾病大鼠气道的细菌负荷, 3.羧甲司坦改善了与细菌粘附和清除相关的气道的粘液高分泌和粘液纤毛清除系统功能,这可能是细菌负荷降低的机制。 4.羧甲司坦预防组效果更优,可能与其抗氧化作用更充分有关。 羧甲司坦是粘痰溶解剂,最新的研究证实体外具有抗炎抗氧化作用,可有效清除活性氧、羟自由基和谷胱甘肽,且粘液溶解剂减少细菌粘附率,其抗细菌粘附特性与粘蛋白相关性很强。我们前期的体内研究证实羧甲司坦可以减少COPD大鼠气道的细菌负荷并减轻了粘液高分泌状态,而吸烟可以通过氧化应激机制引起气道的粘液高分泌,我们推测羧甲司坦可以通过抗氧化机制抑制粘液高分泌,从而减少了细菌的粘附而使气道细菌负荷降低。本研究拟检测羧甲司坦对吸烟诱导的粘液高分泌的效应以及与吸烟诱导粘蛋白产生相关的ROS的产生量。 方法 NCI-H292细胞,人类粘液表皮细胞癌细胞系,处理因素是吸烟和羧甲司坦。以EGFR和ERK特异性抑制剂AG1478和PD98059为干预条件。采用RT-PCR、ELISA和Western-blotting技术观察培养细胞黏蛋白MUC5ACmRNA、MUC5AC蛋白的表达,测定了细胞内ROS产量和以及EGFR和磷酸化EGFR和ERK的量。 结果 羧甲司坦减少了吸烟诱导的MUC5ACmRNA和蛋白的表达,羧甲司坦也减少了吸烟诱导的细胞内ROS的产量。羧甲司坦减少了p-EGFR和p-ERK蛋白的产生。 结论羧甲司坦对吸烟诱导的NCI-H292细胞内粘蛋白的产生的抑制作用部分与ROS的产生相关。且羧甲司坦的这种效应是通过抑制p-EGFR和p-ERK而起作用的。