乙型肝炎病毒编码蛋白对宿主炎性基因的调控作用及其机制研究

乙型肝炎病毒(HBV),为嗜肝DNA病毒科家族成员,能够引起一系列疾病,包括自限性急性肝炎、暴发性肝炎、慢性肝炎、肝硬化以及肝细胞癌。慢性乙型肝炎病毒感染,仍然是一个严重危害健康的全球性疾病问题。据估计,目前全球约有四亿人为慢性HBV感染者,我国是乙肝高发地区,其中1%的慢性乙肝发展为重型肝炎,预后差。HBV编码病毒蛋白被认为在肝脏疾病的发病机制中发挥重要的作用,例如影响病毒的复制和调节宿主基因的表达等。本实验室前期的结果证明：HBV编码HBc蛋白和HBx蛋白能够通过MAPK信号途径激活转录因子c-Ets-2,使其与人纤维介素基因fg12启动子上的顺式作用元件特异性结合,进而激活该基因的转录调控。 凋亡是人类肝脏疾病中最常见的肝细胞损伤机制。尽管有很多刺激和机制能够引起凋亡,肝细胞却特异性的对死亡受体引起的凋亡更易感。至少有三类肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员参与介导HBV感染时肝细胞的凋亡过程,分别为TNF、Fas配体(Fasl)和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor related apop tosis inducing ligand, TRAIL)。TRAIL为一类Ⅱ型跨膜蛋白,属TNF超家族成员,通过与广泛表达于靶细胞表面的TRAIL受体结合,继而将凋亡信号传递给caspase,诱导靶细胞的凋亡,而对正常的细胞不发挥或发挥极微弱的作用。TRAIL在肝细胞死亡中的作用至今仍存在争议,最初在动物模型中的研究认为与TNF和Fasl不同,TRAIL并不引起正常肝细胞的凋亡。然而,随着研究的进一步开展发现,TRAIL能诱导病毒感染、脂肪酸浸润后的肝细胞发生凋亡。在HBV导致的肝脏损害中,TRAIL的表达明显增强,其表达水平与肝脏损害程度呈显著正相关,提示TRAIL参与了HBV导致的重型肝炎的发病机制。 首先,我们设计进行了以下试验来探讨HBV编码相关蛋白是否对人TRAIL基因具有激活作用。pcDNA-HBc、pcDNA-HBs和pcDNA-HBx分别为三种HBV编码蛋白HBc、HBs和HBx的真核表达质粒,我们将上述质粒分别与hTRAIL启动子荧光素酶报告基因质粒及pRL-TK海肾萤光素酶对照报告基因质粒(pRL-TK)共转染到HepG2肝癌细胞系。来研究HBV编码的蛋白是否对hTRAIL基因具有激活作用；若有作用,是何种病毒蛋白发挥活化基因的作用。通过检测报告基因相对荧光素酶(LUC)值反映病毒蛋白对hTRAIL启动子的转录激活作用,结果显示,HBx蛋白能激活hTRAIL基因启动子的转录；采用实时荧光定量和Western Bloting结果显示相对荧光素酶的结果提示：在HepG2细胞,转染pcDNA-HBx组hTRAIL基因的mRNA和蛋白表达水平均高于对照组。而HBc蛋白和HBs蛋白则不能激活该基因的表达。 为研究HBV编码HBx蛋白作用下,参与激活hTRAIL基因的顺式作用元件及反式作用因子,我们进行了系列启动子裁截缺失试验,即构建了一系列5’端缺失而具有共同3’端的hTRAIL基因启动子荧光素酶报告质粒,将其分别与HBV编码HBx蛋白的真核表达质粒共转染HepG2细胞。结果表明：在hTRAIL基因启动子-89位至-29位(相对于转录起始点)之间区域存在着重要的调控序列。为进一步探讨该区域内是否存在转录因子结合位点,我们利用生物信息学软件和数据库进行了分析,结果提示有三个主要候选转录因子结合位点存在于hTRAIL基因启动子的-89位至-29位之间。为了确定起决定作用的转录因子结合位点,我们采用Quick-Change定点突变方法,对hTRAIL基因启动子荧光素酶报告基因质粒的这三个转录因子结合位点分别进行定点突变,酶切结果和测序结果证实三个位点均突变成功。在HepG2肝癌细胞系将HBx真核表达质粒与突变后的hTRAIL启动子荧光素酶报告基因质粒进行共转染实验,检测荧光素酶值结果发现在HBx作用下,两个sp1转录因子结合位点分别突变后质粒的相对荧光素酶活性降低50.1%和52.4%,而其他位点突变后相对荧光素酶活性没有发生显著性改变。凝胶迁移试验表明,转染病毒蛋白HBx真核表达质粒后,HepG2细胞核蛋白能与含有sp1的hTRAIL基因启动子探针特异性结合,而且转录因子sp1的抗体能使该结合条带发生迁移,凝胶迁移实验说明HBx蛋白能使转录因子sp1与hTRAIL基因启动子上相应的顺式作用元件位点发生特异性结合。我们用sp1抗体进行了染色质免疫共沉淀试验来研究在乙型肝炎病毒蛋白HBx作用下与转录因子sp1结合的DNA序列是否存在于是hTRAIL基因启动子上的顺式作用元件。结果表明：在HBx蛋白作用下,以与转录因子sp1结合的DNA序列为模板进行PCR扩增,可扩增到长度为206bp的序列,该序列位于hTRAIL基因启动子上,并包含-89位至-29位(相对于转录起始点),进一步证实在乙型肝炎HBx病毒蛋白作用下,sp1是激活hTRAIL基因所必需的转录因子。为了检测转录因子sp1在细胞内的表达情况,我们采用共聚焦显微镜技术进行检测,结果显示转染了HBx真核表达质粒pcDNA-HBx后,在胞核及胞浆中均可见sp1蛋白的表达,与转染空质粒对照组以、HBs及HBc真核表达质粒组相比,HBx组sp1蛋白的表达强度明显增强。采用RNA干扰的方法对HepG2细胞中sp1的表达进行干预实验,结果显示sp1表达的抑制可使hTRAIL启动子荧光素酶的相对荧光素酶值降低64.8%,此结果进一步证实了转录因子sp1是病毒蛋白HBx激活hTRAIL基因所必需的重要作用因子。上述试验结果表明,病毒蛋白HBx激活宿主hTRAIL基因的转录表达是通过活化转录因子sp1,后者发生核转位,并与核内hTRAIL基因启动子(-89位至-29位之间)上的相应顺式作用元件特异性结合。 以上结果说明,乙型肝炎病毒编码HBx蛋白通过激活转录因子sp1,后者核移位,并与hTRAIL基因启动子上相应的顺式作用元件进行特异性结合,进而上调了hTRAIL基因的表达。本研究从病毒蛋白与宿主基因相互作用方面阐明了hTRAIL基因高度表达的分子机制,进一步阐明了HBV感染后肝细胞凋亡的分子机制,而sp1转录因子有可能成为重型肝炎干预的又一分子靶点。