山葡萄高密度分子遗传图谱构建及抗寒性QTL定位研究

葡萄是我国重要的经济果树，近年来在常规杂交育种方面取得了可喜的进展，但在遗传图谱构建和分子标记辅助育种方面，明显落后于其他经济作物。本研究以欧亚种葡萄‘红地球’和山葡萄‘双优’杂交的94个F1代单株，以山欧杂种‘北冰红’自交的94个F2代单株为作图群体，采用SSR和SRAP两种分子标记技术分别构建了‘红地球’、‘双优’和‘北冰红’的分子遗传图谱，并对‘红地球’、‘双优’及其94个杂交后代，对‘北冰红’及其94个自交后代的抗寒性进行鉴定，最后用区间作图法对葡萄的抗寒性进行了QTL定位研究。葡萄高密度遗传图谱的构建和抗寒性的QTL定位，为今后抗寒基因的定位、克隆以及分子标记辅助育种提供了可靠的理论依据和方法材料，对提高葡萄抗寒育种水平具有重要意义。主要结果如下： 1、成功地建立并优化了适宜山葡萄及其杂交后代的SRAP-PCR反应体系。5因素4水平正交试验结果表明：适宜山葡萄的20μl SRAP-PCR反应体系中各组分最适含量为DNA10ng，Primer0.8μmol·L-1，dNTPs0.2mmol·L-1，Mg2+3.2mmol·L-1，Taq DNA聚合酶2.0U，并含2μl10×buffer（Mg2+free）。利用此反应体系，对24个‘红地球’ב双优’杂交后代进行SRAP-PCR扩增，并电泳检测扩增效果，扩增谱带清晰且多态性较好，该体系可用于葡萄遗传图谱的构建及遗传多样性分析等相关研究。 2、筛选出了447对葡萄SSR引物的最佳退火温度范围。筛选的温度分别为69℃、68.2℃、66.7℃、63.9℃、60.5℃、57.8℃、55.9℃、55℃。电泳检测结果表明，各引物在其最佳退火温度下都能扩增出清晰稳定的条带。 3、利用优化了的SRAP-PCR反应体系成功地对‘红地球’ב双优’的杂交后代进行了杂种的真实性鉴定。用筛选出的5对能够扩增出父本特异条带的SRAP引物对94株杂交后代进行了分析，结果表明：92.6%的杂交后代中出现了清晰、稳定的父本特异条带，结合田间形态学观察，确认为真杂种。 4、利用筛选出的68对SRAP引物和186对SSR引物对‘红地球’ב双优’杂交群体进行扩增，共获得347个SRAP分离位点和186个SSR分离位点。其中母本特有SRAP位点132个，只在母本上表现杂合的SSR位点48个；父本特有SRAP位点155个，只在父本上表现杂合的SSR位点54个；双亲共有SRAP位点60个，在双亲上都表现为杂合的SSR位点84个。利用筛选出的57对SRAP引物和174对SSR引物对‘北冰红’自交群体进行扩增，共获得279个SRAP分离位点和174个SSR分离位点。 5、成功地构建了‘红地球’、‘双优’和‘北冰红’的分子遗传图谱。‘红地球’分子遗传图谱形成19个连锁群，包含266个位点，覆盖总图距1370cM，位点间平均距离为4.8cM；‘双优’分子遗传图谱形成20个连锁群，包含233个位点，覆盖总图距为1254cM，位点之间平均距离为5.0cM；‘北冰红’分子遗传图谱形成21个连锁群，包含228个位点，覆盖总图距为1123cM，位点之间平均距离为4.5cM。 6、鉴定了‘红地球’、‘双优’及其杂交群体的94个单株，‘北冰红’及其自交群体的94个单株的抗寒性。对所有试材的一年生成熟枝条进行低温梯度处理（-15℃、-20℃、-25℃、-30℃、-35℃、-40℃和-45℃），测定了各处理温度下枝条的相对电导率，并与Logistic方程拟合，计算出各亲本及后代单株的半致死温度（LT50），以半致死温度衡量试材的抗寒性。在此基础上，成功地对葡萄抗寒性进行了初步的QTL定位。在‘双优’遗传图谱中检测到1个控制抗寒性的QTL位点，在‘北冰红’遗传图谱中检测到1个控制抗寒性的QTL位点，在‘红地球’遗传图谱中共检测到4个控制抗寒性的QTL位点。