MMPs/TIMPs及炎性因子在SSRIs抗大鼠肺动脉高压作用中的机制研究

前言 肺动脉高压（PAH）是临床常见的以肺血管阻力进行性增加并伴有不可逆的血管构型重建为特征的疾病,严重者可以导致右心室肥厚甚至右心衰竭。其主要病理变化为肺血管收缩性增强,肺血管构型重建,肺小血管内微血栓形成及肺组织炎症反应。引起肺动脉高压的原因很多,包括慢性阻塞性肺疾病（COPD）、肺组织慢性炎症反应、低氧、门脉高压、HIV感染等。肺动脉高压的病理机制复杂,与多种血管活性因子有关,如内皮素（endothelins,ET）、前列环素（prostacyclin）、血栓烷A2（thromboxane A2,TXA2）、一氧化氮（NO）、5-羟色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）等。此外,细胞炎性因子（如TNF-α,IL-1,IL-6,MCP-1）以及血小板活性改变等都参与PAH的形成。 近年来的研究表明,5-HT作为一种内源性血管活性物质在PAH发病机制中起到重要作用。研究发现,肺动脉高压患者血浆中5-HT水平明显高于正常人,体外实验证明高浓度的5-HT能使人离体肺血管明显收缩。另外,5-HT作为一种促有丝分裂素,由位于肺动脉平滑肌细胞膜上的5-羟色胺转运体（serotonintransporter,SERT）介导进入肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）,并通过多种信号转导途径引起PASMCs增生肥大,引起肺动脉血管壁构型重建。Eddahibi等人研究发现肺动脉高压患者PASMCs的SERT表达比正常人显著增高。并且,体外研究也发现,在低氧条件下,PASMCs的SERT不仅蛋白表达增加,其活性也是正常氧浓度条件下的2.5-3.0倍。另外,研究发现家族性肺动脉高压与SERT的基因多态性有关,LL基因型可提高SERT蛋白表达,并且LL基因型患者比SL和SS基因型患者得肺动脉高压的风险高;此外,SERT基因型也可以预示慢性阻塞性肺疾病患者的肺动脉高压严重程度。因此,5-HT及SERT在肺动脉高压形成和发展中的重要作用已受到人们越来越多的关注。 Smoller等人曾提出某些精神疾病（如抑郁症）与呼吸系统疾病具有相关性,5-羟色胺能系统可能参与二者的联系。研究表明,在患有抑郁症的病人中,同时患有COPD的病人占有很高比例;同样,在COPD的病人中,也有高比例的病人同时患有抑郁症。选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRIs）包括氟西汀、舍曲林、帕罗西汀、西肽普兰等,是近年来问世的、治疗效果良好的抗抑郁症药物。其作用机制明确,SSRIs就是SERT的阻断剂,它通过阻断突触前膜上的SERT,抑制5-HT再摄取,提高突触间隙5-HT浓度,从而发挥治疗作用。并且,研究发现神经系统与肺组织中SERT的cDNA有100%的同源性。 上述进展表明,肺动脉高压领域与抑郁症之间存在某种必然联系,而SSRIs是目前治疗抑郁症的有效药物,但SERT能否成为肺动脉高压药物治疗新靶点,SSRIs对肺动脉高压有何影响均不清楚。因此,本论文的研究内容包括:（1）SSRIs对野百合碱诱导大鼠肺动脉高压的抑制作用;（2）SSRIs抗肺动脉高压的机制研究:①SSRIs抑制肺血管构型重建作用机制;②SSRIs抑制肺组织炎症反应机制。 实验材料与方法 建立MCT诱导的慢性肺动脉高压大鼠模型。用不同种类、不同剂量SSRIs给大鼠灌胃三周后,分别检测肺动脉压力,颈动脉压力,右心肥厚指数;病理染色的方法检测肺中小动脉平滑肌增殖指数,炎性改变,弹性纤维及胶原纤维等血管壁细胞外基质（ECM）变化;用RT-PCR方法检测SERT mRNA变化;用Western blot方法检测基质金属蛋白酶MMP-2,MMP-9,基质金属蛋白酶组织抑制因子TIMP-1,TIMP-2及炎性因子IL-1β,MCP-1,TNF-α表达。用统计分析的方法,比较不同组别各指标差异,探讨SSRIs抗肺动脉高压的作用及机制。 实验结果 1、MCT诱导的肺动脉高压大鼠 慢性PAH大鼠模型成功建立。与对照组相比,平均肺动脉压从15.3±2.2mmHg升高到28.0±2.1mmHg（P＜0.01）;右心指数从0.32±0.03增加到0.48±0.08（P＜0.01）;比较大鼠肺血管肌化程度,对照组肺动脉中非肌型动脉、部分肌型动脉和肌型动脉所占的比例分别是60.9%,25.5%和13.6%;MCT组分别是49.5%,17.5%和33.0%。 2、SSRIs氟西汀和舍曲林均降低肺动脉高压、右心指数及抑制肺血管肌化作用 氟西汀和舍曲林均有效的降低了MCT引起的肺动脉高压,从MCT组的28.0±2.1mmHg分别降低到25.4±2.9mmHg（P＜0.05）和23.2±3.1mmHg（P＜0.05）;SSRIs降低右心指数,从MCT组0.48±0.08分别降低到0.41±0.06（P＜0.05）和0.42±0.05（P＜0.05）;比较血管肌化程度,MCT组大鼠肺动脉中非肌型动脉、部分肌型动脉和肌型动脉各占比例为49.5%、17.5%和33%,氟西汀组为61.8.%、24.6%和13.9%,舍曲林为64.9%、23.6%和11.5%。 3、肺动脉SERT基因表达变化 MCT组肺动脉SERT mRNA表达明显高于对照组,从对照组的0.86±0.08升高至0.99±0.06（P＜0.01）。与MCT组比较,氟西汀和舍曲林均减少了SERTmRNA表达,从MCT组0.99±0.06分别降低至0.89±0.03（P＜0.05）和0.82±0.09（P＜0.05）。 4、氟西汀剂量依赖性降低肺动脉压及抑制肺血管壁增厚 氟西汀剂量依赖性的降低了MCT引起的肺动脉高压,从MCT组29.8±7.5mmHg分别降至26.9±5.7mmHg和24.5±3.3 mmHg（P＜0.05）;另外,氟西汀剂量依赖的降低了MCT引起的肺血管壁增厚,与MCT组相比,低剂量组管壁厚度从MCT组53.5%±8.8%降至44.7%±9.7%（P＜0.01）,而高剂量组管壁厚度则降至38.5%±10.1%（P＜0.01 vs MCT）。 5、氟西汀剂量依赖性抑制弹力纤维和胶原增生 用地依红染色方法观察血管壁弹力纤维的变化。MCT组血管壁弹力纤维明显增厚,并且纤维层有断裂,不完整。与MCT组相比,氟西汀低剂量组和高剂量组肺血管壁弹力纤维层厚度均明显减低,结构也相对完整;用Van Gieson方法染色观察血管壁胶原变化。与对照组相比,MCT组血管壁胶原明显增加,支气管周围也有大量弥漫性胶原蛋白,肺组织结构不清楚。氟西汀高剂量组血管壁及支气管周围胶原明显减少,肺组织结构清楚。氟西汀低剂量组胶原也较MCT组减少,并且组织结构相对清楚。 6、氟西汀剂量依赖性降低MMP-2,MMP-9,TIMP-1,TIMP-2表达 用Western blot的方法研究MMP-2,MMP-9,TIMP-1和TIMP-2蛋白表达变化。结果显示,MMP-2,MMP-9,TIMP-1和TIMP-2在对照组表达分别是0.68±0.15,0.59±0.22,0.82±0.08和0.74±0.18,在MCT组分别是1.11±0.15,1.01±0.09,1.03±0.16和1.11±0.17。氟西汀剂量依赖性的降低了各蛋白的表达,MCT+F2组分别降低到0.95±0.20,0.92±0.14,0.77±0.22和0.90±0.08;MCT+F10组为0.80±0.27,0.73±0.16,0.67±0.18 and 0.87±0.10。 7、氟西汀抑制肺组织炎症反应 与对照组相比,MCT组肺动脉血管壁及肺泡壁明显增厚,肺组织结构不清,血管周围有大量炎性细胞浸润,主要包括中性粒细胞、单核巨噬细胞和淋巴细胞。氟西汀剂量依赖性的降低肺血管平滑肌细胞增殖,血管周围炎性细胞减少,肺组织结构清楚。 8、氟西汀剂量依赖降低炎性因子TNF-α,MCP-1和IL-1β表达 用western blot的方法检测炎性因子蛋白表达变化。与对照组比较,MCT组中TNF-α,MCP-1和IL-1β蛋白分别从0.58±0.24,0.64±0.11和0.74±0.19提高到1.00±0.22,0.92±0.12和1.16±0.22。而氟西汀剂量依赖性地抑制了炎性因子的蛋白表达。MCT+F2组TNF-α,MCP-1和IL-1β蛋白表达分别是0.86±0.17,0.87±0.26和0.89±0.19,MCT+F10组为0.53±0.29,0.56±0.07和0.79±0.18。 结论 1、SSRIs（氟西汀和舍曲林）对MCT诱导的慢性炎症性肺动脉高压大鼠模型有明显的抑制肺血管构型重建、减轻右心室肥厚和降低肺动脉压作用,并且该作用与抑制SERT表达有关。 2、氟西汀剂量依赖性的抑制MCT引起的大鼠肺动脉高压和肺血管构型重建。氟西汀减轻肺血管壁ECM胶原和弹力纤维的增生,并抑制MCT诱导的MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2的高表达。提示氟西汀可能通过降低MMPs表达,抑制肺血管ECM增生,从而产生抗血管构型重建作用。 3、氟西汀抑制了MCT引起的肺组织炎症反应,降低TNF-α,MCP-1和IL-1β表达。推测氟西汀通过抑制炎性因子表达,进而抑制MMP-2,MMP-9转录及蛋白表达,减少ECM增生,抑制肺血管构型重构,起到抗肺动脉高压作用。