脾虚证与线粒体基因多态性及胃泌素和ATP酶的相关性研究

脾乃脏象学说的核心，脾主运化是中医脾胃学说的重要理论之一，脾虚证是中医临床上最常见的一类证候。几十年来对脾虚证本质的研究一直是中西医结合证本质研究的热点。本课题基于导师刘友章教授提出的脾与线粒体的相关学说和以往的研究为基础，借助基因与分子生物学技术，从理论、临床、实验三个方面广泛地探讨了脾虚证的病因病机，脾虚证与基因以及胃泌素、ATP酶的相关性。 一、文献与理论研究 通过对古代文献的整理分析，认为脾虚证的病因病机主要为：先天禀赋不足、湿邪困脾、忧思劳倦或饮食不节、苦寒药物损伤脾胃，而致脾失运化，气血生化乏源或脾失统摄，血液妄行。益气健脾是脾虚证的治疗总则。 关于脾虚证的现代研究，大多数学者从脾虚证的致病条件、途径、物质基础对脾虚致病的机制作了大量研究，认为脾虚证可引起消化吸收功能及能量代谢障碍，血液流变学及微量元素的改变，免疫及内分泌生殖功能低下，胃肠激素分泌减少等。 近十余年来，有关脾与线粒体的相关性研究，许多学者比较一致地认为：脾虚证可引起线粒体数目减少，嵴断裂，超微结构改变，及呼吸链氧化酶活性降低，这与刘友章教授八十年代中期提出的脾与线粒体的相关学说相吻合。脾虚证与基因的相关性研究尚处于起步阶段，深入详细报道的文献不多，偶见脾虚与胃癌P53基因表达的相关性研究。以上研究都表明，有关脾虚证的各种病理变化都是以“脾胃为病变中心”。 二、临床研究 为探讨脾虚证与线粒体基因突变及其表达的关系，本课题依据严格的诊断标准、纳入标准、排除标准，将50例慢性胃炎和消化性溃疡患者辨证地分为脾气虚证、脾阳虚证、脾阴虚证、脾胃湿热证四组，清晨空腹抽取抗凝静脉血，采用PCR及基因测序的方法检测患者D环HVR1区1528bp核酸片段的基因序列，并与GenBank序列进行同源性比较，试图寻找与脾虚证有关的碱基突变。同时采用FQ-PCR方法检测患者1528bp核酸片段的表达。 结果显示： （1） 1528bp核酸片段共发现46个位点，436个碱基变异，其平均变异密度约为1.12个变异／每人每100个碱基，可变碱基的主要变异形式为碱基转换，其次为插入、缺失和颠换。 （2） 1528bp核酸片段16223位点C→T较高的变异频率（40％），可能是引起脾虚证的原因之一，其机理尚不明。 （3）脾气虚证组的碱基平均变异率最高，明显高于脾阳虚证、脾阴虚证、脾胃湿热证组（P＜0.01或P＜0.05）。 （4）消化性溃疡患者碱基平均变异率显著高于胃炎患者（P＜0.01）。 （5）脾胃湿热证组1528bp核酸片段的表达明显高于脾虚证各组（P＜0.05）。 （6）各证型组胃炎患者1528bp核酸片段的表达高于消化性溃疡患者，但无统计学差异（P＞0.05）。 三、实验研究 本研究采用陈氏破气苦降加饥饱失常法复制脾虚证大鼠模型，用放免法检测大鼠血清胃泌素含量，用定磷酶促法测定大鼠红细胞膜、肝及骨骼肌线粒体Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+ATPase的活性。 结果显示： （1）四组益气健脾中药治疗组和正常对照组GAS含量均高于脾虚模型组，同脾虚模型组比较具有显著性差异（P＜0.01），益气健脾中药治疗组GAS含量均高于正常对照组，与正常对照组比较有显著性差异（P＞0.05）(当归补血汤组除外)。 （2）六组大鼠红细胞膜ATPase活性的比较，脾虚模型组ATPase活性最低，而益气健脾中药组ATPase活性（当归补血汤组除外）虽比正常对照组稍低（P＞0.05），但均显著地高于脾虚模型组（P＜0.01），当归补血汤组ATPase活性升高的程度最低，但高于脾虚模型组（P＜0.05），低于正常对照组（P＜0.05）。 （3）肝细胞线粒体ATPase活性的比较，脾虚模型组显著低于正常对照组（P＜0.01），四组益气健脾中药组ATPase的活性稍低于正常对照组，但与脾虚模型组比较均有显著地升高（P＜0.01或P＜0.05），依次是当归补血汤合四君子汤组＞黄芪四君子汤组＞四君子汤组＞当归补血汤组。当归补血汤组ATPase的活性虽有升高，但明显低于正常对照组（P＜0.05）。 （4）大鼠骨骼肌线粒体ATPase活性的比较，脾虚模型组显著低于正常对照组和四组益气健脾中药组（P＜0.01或P＜0.05），黄芪四君子汤组ATPase的活性显著高于正常对照组（P＜0.05），其它益气健脾中药组与正常对照组比较无显著性差异（P＞0.05）。 四、结论 本研究是在刘友章教授提出的脾与线粒体相关学说的指导下，采用临床与实验相结合的研究方法，得出了较为客观的研究结果，提示脾虚证存在着基因的多态性及基因的异常表达；胃泌素含量的下降；ATPase活性的降低。从基因、分子生物学层面，确切地阐明了脾虚证的实质内涵，从而拓宽了以往对脾虚证的研究仅仅停留于对系统、器官、组织研究的局限性，为临床治疗脾虚证提供了客观实验依据。